Черткова А.И., Славина Е.Г., Лейпунская И.Л., Кадагидзе З.Г.

Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина, Москва

Введение

Химиотерапия, являющаяся основным методом лечения при злокачественных опухолях, осложненных метастазами, оказывается эффективной и обеспечивает значительное увеличение продолжительности жизни больных лишь в небольшом проценте случаев. Большинство метастатических вариантов рака или резистентны к химиотерапии, или становятся таковыми в процессе лечения [1, 2, 3, 4]. Резистентность к химиопрепаратам может развиваться на разных этапах взаимодействия веществ с клеткой. Примером резистентности, возникающей до взаимодействия агента с внутриклеточной мишенью на уровне клеточной мембраны, является так называемая множественная лекарственная устойчивость. Множественная лекарственная устойчивость – термин, используемый для обозначения резистентности опухолевых клеток к структурно и функционально несвязанным гидрофобным веществам, которая приобретается клеткой после воздействия какого-либо одного из таких агентов. Эта резистентность, как правило, связана с гиперэкспрессией гена MDR1, который кодирует мембранный Р-гликопротеин (Pgp) с молекулярной массой 170 kDa. Pgp снижает внутриклеточную концентрацию своих субстратов путем их энергозависимого выброса из клетки. Этот механизм обуславливает резистентность клетки к широкому спектру соединений, включая Vinca алколоиды, колхицин, таксол, антрациклины и актиномицин D, поддерживая концентрацию этих агентов в клетке ниже той, которая необходима для проявления цитотоксичности [1, 4, 5, 6, 7]. В настоящей работе было проведено изучение способности низкомолекулярного индуктора интерферона неовира изменять чувствительность НТ-29 и К-562 клеток, интактных и трансформированных геном MDR1, к цитотоксическому действию противоопухолевых лекарств.

Материалы и методы

Клеточные культуры

К-562 (клетки эритролейкемии человека), НТ-29 (клетки аденокарциномы толстого кишечника человека), интактные и трансформированные геном множественной лекарственной устойчивости MDR1. Клетки К-562 MDR1 были получены от профессора И. Ронинсона (Иллинойский университет, Чикаго, США). Клетки НТ-29 MDR1 были получены Е.Г. Славиной трансфекцией ретровирусной конструкцией с геном MDR1 и последующей селекцией культивированием в присутствии возрастающих доз винкристина с помощью сотрудников лаборатории молекулярной генетики (руководитель профессор А.В. Гудков) в том же университете. Клетки культивировали в среде RPMI-1640 (К-562), и DMEM (НТ-29) (обе среды производства института полиомиелита и вирусных энцефалитов РАМН, Москва) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (GIBCO), 2mM L-глютамина и 80 мг/ л гентамицина.

Изучение цитотоксического действия препаратов

Клетки рассеивали в 96-луночные плоскодонные (НТ-29) или круглодонные (К-562) планшеты (Costar) в количестве 104 клеток/ мл по 100 или по 200 мкл/ лунку. Клетки НТ-29 выращивали в термостате при 370С в атмосфере 5% СО2 24 часа, после чего ростовую среду заменяли раствором неовира в культуральной среде в концентрациях 10, 0,1 и 0, 001 мг/ мл и инкубировали клетки в термостате еще 24 часа. Клетки К-562 засевали в лунки планшет одновременно с неовиром. После 24-часовой инкубации клеток в растворе неовира препарат удаляли и заменяли раствором доксорубицина, винкристина (оба препарата производства Teva, Израиль) или 5-фторурацила (5-ФУ) (Lemery, Мексика). Через 48 часов определяли цитотоксический эффект препаратов, используя высокочувствительный колориметрический метод (МТТ-тест) [8]. Оптическую плотность (ОП) образцов измеряли на спектрофотометре Multiscan Reader MR700 (Dynatech, UK). Процент цитотоксичности определяли по формуле 100 – (среднее значение ОП в опыте/ среднее значение ОП в контроле * 100). 50% цитотоксическую дозу (ЦД50) определяли регрессионным анализом по программе Sigma Plot for Windows (Jandel Sciontific, USA).

Статистический анализ

Статический анализ цитотоксической активности проводили по t-критерию Стъюдента, а средних значений ЦД50 – с использованием U-критерия Вилкоксона-Манна-Уитни.

Результаты

В наших опытах 50%-я цитотоксическая доза (ЦД50) доксорубицина для клеток НТ-29 составляла в среднем 17,7+5,8 мкг/ мл, а для клеток НТ-29 MDR1 98,7+35,96 мкг/ мл. Для клеток К-562 и К-562 MDR1 ЦД50 составила 3,5 и 15,0 мкг/ мл, соответственно. Неовир в концентрации 10 мг/ мл обладал прямым, хотя и не постоянным, цитотоксическим действием в отношении клеток (цитотоксическая активность в разных опытах колебалась от 0% до 36,5%). В концентрации 0,1 мкг/ мл его токсичность была минимальной (до 10%), а при концентрации 0,001 мг/ мл полностью отсутствовала. Неовир повышал чувствительность клеток всех использованных линий к цитотоксическому действию доксорубицина и винкристина. Степень усиления токсичности зависела как от концентрации неовира, так и от концентрации химиопрепаратов, а также от линии клеток. Наиболее выраженным эффектом обладал неовир в концентрации 10 мг/ мл. Предварительная обработка клеток НТ-29 и НТ-29 MDR1 неовиром в этой концентрации усиливала цитотоксический эффект доксорубицина, использованного в концентрациях 10; 1; 0,1; 0,01 и 0,001 мкг/ мл, но не 100 мкг/ мл. Усиление токсического действия доксорубицина в отношении клеток НТ-29 носило, как правило, аддитивный характер, а в отношении клеток НТ-29 MDR1 в большинстве случаев взаимодействие препаратов было синергистическим. ЦД50 доксорубицина при этом уменьшалась в 2,85 раза для клеток НТ-29 и в 8,67 раза для клеток НТ-29 MDR1. Неовир в концентрациях 0,1 0,001 мг/ мл лишь в одном опыте из трех незначительно повышал цитотоксическое действие 10 и 1 мкг/ мл доксорубицина на клетки НТ-29. В отношении клеток НТ-29 MDR1 эффект неовира в разных опытах колебался от незначительного повышения токсического действия доксорубицина до его уменьшения. Предварительная обработка клеток НТ-29 и НТ-29 MDR1 неовиром в концентрации 10 мг/ мл повышала также их чувствительность к винкристину при всех использованных концентрациях последнего (Таблица 1).

Таблица 1. Модуляция неовиром чувствительности MDR1- и MDR1+ клеток к винкристину

* - средний % цитотоксичности в группе «винкристин+неовир» – средний % цитотоксичности в группе «винкристин»;
** - P < 0,05

Наибольшее усиление токсичности винкристина в отношении клеток НТ-29 наблюдалось при использовании его в концентрациях 0,001 и 0,1 мкг/ мл, а в отношении клеток НТ-29 MDR1 – в концентрации 0,1 мкг/ мл. Эффект усиления токсичности препарата не зависел от экспрессии гена MDR1. Взаимодействие препаратов в большинстве случаев было синергестическим. В среднем токсичность неовира в этих опытах составляла 20,5+8,08% для клеток НТ-29 и 18,1+10,6% для клеток НТ-29 MDR1. Неовир в дозе 0,1 и 0,001 мг/ мл также повышал токсическую активность винкристина в отношении клеток обеих линий, однако этот эффект был непостоянным, наблюдался не при всех дозах винкристина, а в некоторых случаях отмечалось даже некоторое снижение токсичности препарата. Способность неовира повышать чувствительность клеток цитотоксическому действию химиопрепаратов проявилась и в опытах на клетках линий К-562 и К-562 MDR1. В концентрации 10 мг/ мл он в 3,18 раза повышал чувствительность клеток К-562 и более чем в 100 раз клеток К-562 MDR1 к доксорубицину. Неовир повышал также чувствительность клеток К-562 и К-562 MDR1 к винкристину, однако, это повышение было достоверным только в отношении клеток К-562 MDR1 (Таблица 1). Опыты по изучению влияния неовира на токсическую активность 5-фторурацила, не являющегося субстратом Pgp, показали, что клетки НТ-29 MDR1 были значительно более чувствительны к цитотоксическому действию этого препарата, чем клетки НТ-29. Неовир в концентрации 10 мг/ мл усиливал токсическое действие препарата в отношении клеток обеих линий, хотя более эффективно в случае клеток НТ-29. Предварительная инкубация клеток НТ-29 с неовиром приводила к снижению ЦД50 5-фторурацила в 2000 раз, и клеток НТ-29 MDR1 – в 36,6 раза.

Обсуждение

Полученные результаты позволяют сделать следующие выводы. Неовир повышает чувствительность клеток как с MDR1-, так и с MDR1+ фенотипом к цитотоксическому действию доксорубицина и винкристина, причем этот эффект во многих случаях в большей степени выражен в отношении клеток резистентной линии. Неовир эффективно усиливает цитотоксическое действие 5-фторурацила, накопление которого не зависит от экспрессии Pgp, в отношении клеток и чувствительной и резистентной линий. Неовир – натриевая соль 10-метиленкарбоксилат-9-акридона, является высокоэффективным низкомолекулярным индуктором интерферона, в особенности ИФН-a [9, 10]. Имеются многочисленные данные о том, что ИФН в условиях in vitro способен повышать противоопухолевую активность различных химиопрепаратов [11]. Показана также антипролиферативная активность ИФН-a и -g в отношении линий клеток с MDR1 фенотипом [12] и способность ИФН-a усиливать модулирующую активность моноклональных антител, направленных против Pgp in vitro и повышать противоопухолевый эффект этих антител in vivo [13]. Ранее мы установили, что a-интерферон в концентрации 20 и 200 МЕ/ мл при воздействии на клетки одновременно с препаратом, усиливал цитотоксическое действие доксорубицина, винкристина, а также 5-фторурацила в отношении клеток и с MDR1- и с MDR1+ фенотипом [14]. В наших опытах взаимодействие неовира с химиопрепаратами носило как аддитивный, так и синергистический характер. Можно предположить, что эффект усиления токсической активности лекарств неовиром связан как с непосредственной суммацией эффектов двух последовательно взаимодействующих препаратов, так и с влиянием неовира на какие-то клеточные структуры и/ или функции, результатом которого является повышение чувствительности клеток к последующему воздействию химиопрепарата. Эффект неовира, по-видимому, не связан с воздействием на механизмы множественной лекарственной устойчивости и обусловлен какими-то другими причинами.

Литература

• Делекторский В.В., Малиновская В.В., Стрижаков А.Н., Яшкова Г.Н., Каграманова Ж.А. и соавт. Неовир (Камедон), индуктор интерферона в комплексном лечении хронических воспалительных заболеваний придатков матки хламидийной этиологии (клинико-электронномикроскопическое исследование). Антибиотики и Химиотерапия, 1995. – Т. 40 (5). – С. 42-47.
• Gottesman M.M. Molecular basis of therapy. J. Natl. Cancer Inst. 1994. – V. 86. – P. 1277-1285.
• Satta T., Isobe K., Yamauchi M., Nakashima J. et al. Establishment of drug resistance in human gastric and colon carcinoma xenograft lines. Jpn. J. Cancer Res. 1991. – V. 82. – P. 593-598.
• Chowdhary S.A., List A.F., Drug resistance: overview of mechanisms. Encyclopedia of Cancer 1997. – V. 1. – P. 610-620.
• Gottesman M.M., Pastan J. Biochemistry of multidrug resistance mediated by multidrug transporter. Annu. Rev. Biochem. 1993. – V. 62. – P. 385-427.
• Roninson J.B. Multidrug resistance. Encyclopedia of Cancer 1997. – V. 2. – P. 1095-1107.
• Laing N.M., Tew K.D. Drug resistance to chemotherapy: mechanisms. Encyclopedia of Cancer 1997. – V. 1. – P. 560-570.
• Jaffrezou J-P., Levade Th., Chatelain P., Laurent G. Modulation of subcellular distribution of doxorubicin in mulidrug-resistant P388/ ADR mouse leukemia cells by the chemosensitizer í(2-Isopropyl-1-í4-[3-N-methyl-N-(3,4-dimethoxy-b-phenethyl) amino] propyloxyý-Benzenesulfonylýý indolizine. Cancer Res. 1992. – V. 52. – P. 6440-6446.
• Carmichael J., DeGraff W.G., Gazdar A.F. et al. Evaluation of a tetrazolium-bazed semiautomated colorimetric assay: assessment of chemosensitivity testing. Cancer Res. 1987. – V. 47. – P. 936-942.
• Sergeev A.Y., Sergeev Y.V. Neovir: the new super-inducer of endogenous interferon on treatment of resistant forms of urogenital chlamidiosis. J. EADF 1996. – V. 7. – P. 197.
• Wadler S., Schwartz E.L. Antineoplastic activity of the combination of interferon and cytotoxic agents against experimental and human malignancies: a review. Cancer Res. 1990. – V. 50. – P. 3347-3348.
• Reddy P.G., Graham G.M., Datta S. et al. Effect of recombinant fibroblast interferon and recombinant immune interferon on growth and the antigenic phenotype of multidrug-resistant human glioblastoma multiforme cells. J. Natl. Cancer Inst. 1991. – V. 83. – P. 1307-1315.
• Fogler W.E., Pearson J.W., Volker K. et al. Enhancement by recombinant human interferon-alpha of the reversal of multidrug resistance by MRK-16 monoclonal antibody. J. Natl. Cancer Inst. 1995. – V. 87. – P.94-103.
• Slavina E.G., Zabotina T.N., Dzgamadze N.T., Leipunskaya I.L., Kadagidze Z.G. Enhancement of the growth inhibiting action of the human colon carcinoma cells by recombinant a-interferon. 8th Intern. Congress of Anticancer Treat. 1998. – P.192.

Russian Journal of Immunology 2000. – V. 5. – N. 4. – P. 385-390.