Вопросы онкологии. 2003. том 49. №2. С. 170-175.
Останин А.А., Центнер М.И., Хонина Н.А, Леплина О. Ю.,
Шевела Е.Я., Никонов С.Д., Ступак В.В., Черных Е.Р.
НИИ клинической иммунологии СО РАМН,
НИИ травматологии и ортопедии Минздрава РФ,
Новосибирск

Целью работы явилось изучение иммунитета в динамике проведения комплексного лечения, а также оценка эффективности экстракорпоральной антигенспецифической иммунотерапии (ЭАИТ) у больных с внутримозговыми опухолями. ЭАИТ проводили в режиме " пилотных " исследований в соответствии с ранее разработанным патентом. Исходно у больных регистрировалось снижение количества HLA-DR+ моноцитов и угнетение их пролиферативной активности in vitro. Проведение в раннем послеоперационном периоде индукторной фазы ЭАИТ предупреждало углубление дисфункции иммунной системы под влиянием факторов оперативного вмешательства. За период 1998-2000 гг. ЭАИТ была выполнена у 33 больных с анапластическими астроцитомами (АА, n=20) и глиобластомами (ГБ, n=13). Средняя курсовая доза вводимых клеток составила 2,43±0,18х109/больного. Лечение по предложенному протоколу было хорошо переносимым. В настоящее время собрана информация о 31 больном, из которых 22 человека живы и находятся под наблюдением, и 9 человек (4 с ГБ и 5 с АА) умерли (летальность 29%). Средняя продолжительность безрецидивного периода у живых больных составила 14±2 мес. (n=22), при этом стойкая ремиссия длительностью 1-2 года зарегистрирована в 37,5% (3/8) и 64% (9/34) случаев у больных ГБ и АА соответственно. Через год после окончания ЭАИТ у больных, как правило, регистрировалось полное восстановление показателей иммунитета. Таким образом, использование комплексного подхода (оперативное лечение в сочетании с ЭАИТ) позволяет повысить эффективность лечения больных с внутримозговыми опухолями.

Ключевые слова: иммунитет, антигенспецифическая иммунотерапия, цитокины, злокачественные глиомы человека.

В последние годы в России, как и в других странах мира, прослеживается тенденция к увеличению заболеваемости опухолями центральной нервной системы [8, 9]. По данным различных авторов, среди первичных опухолей головного мозга глиомы составляют в среднем 40-55%, причем наиболее часто (до 60% случаев) встречаются анапластические астроцитомы (АА) и глиобластомы (ГБ). Эта группа внутримозговых опухолей объединяется как общим происхождением из астроцитарной глии, так и рядом специфических особенностей: отсутствием четких границ с мозгом, частым рецидивированием, низкой чувствительностью к химио- и радиотерапии. Несмотря на то, что в лечении злокачественных опухолей мозга часто используется комплексный подход, включающий в себя оперативное вмешательство и химиолучевую терапию, средняя продолжительность жизни большинства больных с низкодифференцированными глиомами не превышает 12 мес., а показатели 5-летней выживаемости варьируют в диапазоне от 3,5 до 12% [2,З]. В настоящее время перспективы лечения злокачественных опухолей головного мозга во многом связывают с новейшими биотехнологиями, в частности, с разработкой и внедрением в практику методов экстракорпоральной иммунотерапии.

С целью усиления противоопухолевого иммунитета используют неспецифический и антигенспецифический варианты проведения иммунотерапии. В рамках первого подхода при лечении опухолей различной локализации применяют, как правило, цитокины (интерфероны, интерлейкин-2), полиадъюванты, а также лимфокин-активированные киллерные (ЛАК) клетки [6, 10, 11]. Примером второго подхода является использование внутривенных инфузий аутологичных лимфоцитов, активированных ех vivo опухолевыми антигенами и смесью нативных цитокинов [1,5]. Однако в силу наличия гематоэнцефалического барьера внутривенное введение аутологичных антигенспецифических лимфоцитов или ЛАК-клеток часто оказывается недостаточно эффективным в отношении злокачественных опухолей так называемых "забарьерных тканей", в частности, внутримозговой локализации.

Кроме того, достоверное увеличение продолжительности безрецидивного периода при проведении неспецифической и/или антигенспецифической иммунотерапии регистрируется у больных при условии максимальной хирургической резекции опухоли. Важно отметить, что возможность тотального удаления глиом мозга ограничена как визуально определяемыми во время операции границами опухоли и физиологической значимостью пораженных зон мозга (даже с использованием увеличительной оптики), так и инфильтрацией опухолевыми клетками перифокальной зоны, которая достигает 2 см[2].

Исходя из выше изложенного, наши исследования были направлены на разработку нового метода экстракорпоральной антигенспецифической иммунотерапии (ЭАИТ), включение которого в программу комплексного лечения злокачественных глиом головного мозга позволило бы повысить уровень качества жизни и увеличить продолжительность безрецидивного периода у больных с внутримозговыми опухолями.

Материал и методика

За период 1998-2000 гг. клинико-иммунологические исследования выполнены в группе 45 больных со злокачественными опухолями головного мозга. Из данных, представленных в табл.1, видно, что глиомы (астроцитомы и глиобластомы) головного мозга в 2-4 раза чаще развивались у мужчин. Средний возраст больных составил 41±2 года, при этом примерно с равной частотой встречались пациенты моложе и старше 40 лет. В целом по группе подавляющее большинство случаев (82%) было представлено первичными опухолями мозга, и только у 8 больных обследование и лечение проводились по поводу возврата заболевания. В наших наблюдениях анапластическая астроцитома несколько чаще регистрировалась справа, тогда как глиобластома характеризовалась тенденцией к левополушарной локализации. Как правило, опухолевый процесс затрагивал белое вещество теменной и височной долей (более 50% всех наблюдений), или располагался на стыке 2-3 областей(29% случаев).

Таблица 1
Характеристика больных со злокачественными опухолями головного мозга

Всем больным было проведено оперативное лечение. После костно-пластической трепанации черепа в проекции опухоли под увеличением в 4,4 раза патологический опухолевый субстрат удаляли с использованием микрохирургической техники и ультразвукового аспиратора. Затем осуществляли тщательный гемостаз и производили пластику твердой мозговой оболочки гомотрансплантатом. В 33 из 45 случаев (73% больных) через контраппертуру (в 1 см от основного разреза) в ложе удаленной опухоли устанавливался хлорвиниловый катетер, который фиксировался лигатурами. У подавляющего (91%) числа больных была выявлена субтотальная резекция опухоли, которая осуществлялась в пределах визуально определяемых границ. В целом по группе средний объем удаленной опухоли составил 163±19 см3.

У 33 пациентов комплексное лечение включало экстракорпоральную иммунотерапию, которую проводили в режиме пилотных исследований в соответствии с ранее разработанным патентом [4]. Кратко, до начала ЭАИТ проходила подготовительная стадия получения суспензии аутологичных опухолевых клеток, которые после соответствующей инактивации и консервации далее использовали в качестве источника опухолевых антигенов. На 3-4-е сутки послеоперационного периода с целью ранней иммунокоррекции проводили первую, индукторную фазу ЭАИТ в виде внутривенных инфузий перфузата ксеноселезенки (ПКС) - комплексного препарата, содержащего смесь нативных цитокинов [7]. Основной этап ЭАИТ заключался в последовательном проведении 6 процедур выделения из крови пациента мононуклеарных клеток (МНК) и их культивирования в течение 48 ч с рекомбинантным интерлейкином-2 (рИЛ-2, "Ронколейкинa ", производства 000 "Биотех", Санкт-Петербург) и аутологичными опухолевыми антигенами. Полученные клетки вводили в ложе удаленной опухоли в сочетании с Ронколейкином в оптимальной дозе. Средняя курсовая доза введенных клеток составила 2,43±0,18x109 /больного. Завершали ЭАИТ 10-15 подкожными инъекциями смеси аутологичных цитокинов, полученных при культивировании лимфоцитов больного с опухолевым антигеном в присутствии рИЛ-2.

Таблица 2
Шкала оценки уровня качества жизни

Комплексное лечение дополнялось последующим проведением дистанционной лучевой терапии в суммарной дозе 50-60 Гр. В процессе лечения оценивалось общее состояние больных на основании результатов клинико-лабораторных и инструментальных методов исследования, включая ЯМР томографию, электроэнцефалографию головного мозга, оценку зрительных вызванных потенциалов. До операции и перед выпиской определяется неврологический статус пациента, при этом особое внимание отводилось оценке уровня качества жизни по шкале Карновского в нашей модификации (табл. 2).

При исследовании иммунного статуса больных методом проточной цитофлюориметрии (FACS, Becton Dickinson), используя соответствующие моноклональные антитела (ТОО "Сорбент", Москва) определяли содержание различных субпопуляций клеток (CD3+, CD4+ и CD8+ T-лимфоцитов, CD20+ B-лимфоцитов, CD16+ NK-клеток), а также относительное количество лимфоцитов и моноцитов, экспрессирующих HLA-DR антигены. Рассчитывали величину иммунорегуляторного CD4/CD8 индекса. В культурах МНК оценивали интенсивность спонтанной и митоген-индуцированной (конканавалин А, КонА 15 мкг/мл) пролиферации (по включению Н3-тимидина). Исследования иммунитета осуществляли до и после операции, а также после окончания курса ЭАИТ. Контрольную группу при изучении иммунного статуса больных составили 40 здоровых доноров крови в возрасте от 20 до 50 лет.

Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической н непараметрической статистики на персональном компьютере с использованием программы "STATISTICA 5.0"

Результаты и обсуждение

Исследования иммунного статуса больных со злокачественными глиомами, выполненные до проведения оперативного вмешательства, показали, что развитие опухолевого процесса в головном мозге сопряжено с изменениями количественных и функциональных показателей иммунитета (табл. 3).

Так, по сравнению со здоровыми донорами у больных регистрировалось достоверное снижение относительного содержания HLA-DR+ моноцитов и выраженное угнетение спонтанной и митоген-индуцированной пролиферативной активности МНК в условиях in vitro. Статистически значимых различий в исходном состоянии иммунитета больных в зависимости от гистологических особенностей опухоли (глиобластомы в сравнении с астроцитомами) выявлено не было. Анализ динамики иммунологических параметров показал, что проведение в раннем послеоперационном периоде индукторной фазы ЭАИТ с использованием нативных цитокинов (ПКС) позволило предупредить дальнейшее углубление дисфункции иммунной системы, индуцированное факторами оперативного вмешательства (травма, стресс, наркоз, кровопотеря). Перед началом курса ЭАИТ у больных регистрировалось лишь умеренное снижение КонА-индуцированного пролиферативного ответа (с 36380±4190 до 25770±3890 имп/мин pu<0,05), тогда как все остальные параметры иммунного статуса не отличались от дооперационного уровня.

Таблица 3
Сравнительная оценка показателей иммунного статуса в группах здоровых доноров
и больных со злокачественными опухолями головного мозга

Примечания: *pu <0,05; ** pu <0,01 - достоверность различий показателей по сравнению с донорами (U - непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни). Индекс влияния КонА (ИВКонА) рассчитывали как отношение интенсивности КонА-индуцированного пролиферативного ответа клеток к уровню спонтанной пролиферации.

Экстракорпоральная антигенспецифическая терапия была проведена у 20 больных с анапластическими астроцитомами и 13 больных с глиобластомами. Исходное состояние пациентов, оцененное по шкале Карновского, в анализируемых группах не различалось (56±4 и 55±5 баллов) так же, как и средняя курсовая доза клеток, полученных больными при проведении ЭАИТ (2,42±0,23 и 2,43±0,29х109/больного). Курсовое лечение по предложенному протоколу было хорошо переносимым и не сопровождалось развитием каких-либо серьезных побочных или токсических реакций. Напротив, многие больные отмечали субъективное улучшение, а проведенная по окончании ЭАИТ оценка качества жизни показала статистически значимое увеличение среднего уровня до 83 и 76 баллов у больных с глиобластомами и астроцитомами, соответственно.

В настоящее время точные данные катамнеза собраны о 31 из 33 больных, прошедших курс ЭАИТ. Из них на начало февраля 2001 г. 22 человека живы (71%) и 9 человек умерли (29%). В группе больных с глиобластомами летальность составила 33% (4/12). Из 19 больных с астроцитомами умерли 5 пациентов (летальность 26%), у 3 из которых ЭАИТ проводилась по поводу прогрессирования заболевания. Среди умерших больных продолжительность жизни после завершения комплексного лечения, как правило, не превышала 1 года, составляя в среднем 8±2 мес. Средняя продолжительность безрецидивного периода у живых больных злокачественными глиомами составила 14±2 мес (n=22). Отметим, что стойкая ремиссия длительностью от 1 года до 2 лет зарегистрирована в 37,5% (3/8) и 64% (9/14) случаев у больных ГБ и АА соответственно.

Проведенный сравнительный анализ умерших больных (n=9) и пациентов с продолжительностью ремиссии более 12 мес. (n=12) показал (табл. 4), что у пациентов первой группы был достоверно ниже исходный уровень качества жизни, а также почти в 1,7 раза больше средний объем удаленной опухолевой массы. Несмотря на то, что средний возраст больных в анализируемых группах значимо не различался, пациенты старше 60 лет были только в группе умерших больных (Pтмф=0,021). Каких-либо статистически значимых различий по полу, частоте рецидивирования, курсовой дозе клеток, показателям иммунного статуса до/после операции, а также после окончания ЭАИТ в этих сравниваемых группах выявлено не было.

Таблица 4
Сравнительная характеристика умерших больных со злокачественными глиомами и больных с продолжительностью ремиссии более 12 мес

Следует отметить, что в целом по группе пациентов со злокачественными глиомами, прошедших курс ЭАИТ (n=33), состояние иммунитета больных после завершения комплексного лечения оставалось стабильным, при этом отмечалась умеренно выраженная тенденция к усилению пролиферативной активности МНК. Полная нормализация измененных показателей иммунного статуса (относительного количества HLA-DR+ моноцитов, митогенной реактивности клеток) происходит у больных, по-видимому, в более поздние сроки. Данное предположение проиллюстрировано на рисунке, где показана динамика восстановления уровня КонА-индуцированного пролиферативного ответа МНК у трех пациентов в ближайшем и отдаленном периоде после проведения курса экстракорпоральной антигенспецифической иммунотерапии.

Таким образом, установлено, что развитие опухолевого процесса в головном мозге сопряжено со снижением количественных (относительного содержания HLA-DR+ моноцитов) и функциональных (пролиферативной активности клеток) параметров иммунитета у больных со злокачественными глиомами. В результате проведения курса ЭАИТ не регистрировалось дальнейшего снижения иммунитета под влиянием факторов оперативного вмешательства. Напротив, либо в ближайшем (у части больных), либо в отдаленном послеоперационном периоде происходило постепенное восстановление измененных иммунологических показателей. По завершении программы комплексного лечения отмечалось статистически значимое повышение уровня качества жизни оперированных больных. За трехлетний период наблюдения летальность больных с глиобластомами и анапластическими астроцитомами составила 33 и 26% соответственно. Средняя продолжительность безрецидивного периода среди пациентов, находящихся под наблюдением, составила 14±2 мес. При этом стойкая ремиссия длительностью свыше 24 мес. зарегистрирована у 5 из 12 больных (41,7%), у которых после окончания ЭАИТ прошло более одного года.

Динамика восстановления пролиферативной активности МНК в процессе лечения больных со злокачественными опухолями головного мозга

По оси ординат - интенсивность КонА-индуцированного пролиферативного ответа(имп./мин х 10 -3).

По оси абсцисс - иммунологические обследования: 1 -до операции; 2 - после операции; 3 - после окончания ЭАИТ; 4 - через 12 мес после окончания лечения.

Отдельно представлены нормативные значения КонА-стимулированной пролиферации МНК здоровых доноров в виде М ± S.Е. и диапазона квартильных отклонений.

В заключение следует отметить, что предлагаемый протокол экстракорпоральной антигенспецифической иммунотерапии, конечно, не является панацеей. Тем не менее, судя по предварительным данным, можно надеяться, что использование такого подхода в комплексном лечении злокачественных глиом позволит существенно улучшить качество и увеличить продолжительность жизни больных с опухолями головного мозга.

ЛИТЕРАТУРА

1. Власов А.А., Новиков В.И., Карандашов В.И., Сидорович И.Г. Послеоперационная иммунотерапия больных со злокачественными новообразованиями // Рос. мед. журнал. - 1996. - № 6. - С.17-19.
2. Земская А.Г., Лещинский Б.И. Опухоли головного мозга астроцитарного ряда. -Л., 1965. - 216 с.
3. Марченко С.В. Комплексное лечение злокачественных глиом полушарий большого мозга: Автореф. дис. к. м. н. -СПб., 1997. -24 с.
4. Никонов С.Д., Черных Е. Р. , Останин А.А. и др. Способ комбинированной иммунотерапии злокачественных опухолей головного мозга // Заявка на изобретение № 2000111634 / 14 (012134), приоритет от 10.05.2000 г.
5. Новиков В.И., Власов А.А., Карандашов В.И., Рязанов Н.К. Иммунотерапия злокачественных новообразований челюстно-лицевой области человека аутологичными препаратами в послеоперационном периоде // Иммунология. - 1995. - № 2. - С. 54-56.
6. Свадовский А.И. Способ лечения внутримозговой опухоли головного мозга // Патент РФ № 2133624, 1999 г.
7. Черных Е.Р., Хонина Н.А., Шевела Е.Я. и др. Влияние перфузата селезенки свиньи на активацию естественных киллерных клеток // Эксп. онкол. - 1994. - Т. 16, № 4-6. - С. 387-391.
8. Ярцев В.В., Коршунов А.Г., Непомнящий В.П. Некоторые аспекты эпидемиологии и классификации опухолей нервной системы // Вопр. нейрохир. - 1997. - № З. - С. 9-13.
9. Davis F.G., Malinski N., Haenzel W. et al. Primary brain tumor incidence rates in four United States regions, 1985-1989: a pilot study // Neuroepidemiology (Switzerland). - 1996.-Vol. 15.-P. 103-112.
10. Rosenberg S.A. Immunotherapy of cancer using interleukin-2: current status and future prospects // Immunol. Today.-1988.-Vol. 9.-P.58-62.
11. Rosenberg S.A., Lotze M.T., Muul L.M. et al. A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine activated killer cells and interleukin-2 or high dose interleukin-2 alone// N. Engl. J. Med.-1987.-Vol. 316.-P. 889-897.

ANTIGEN-SPECIFIC IMMUNOTHERAPYBR AS A COMPONENT OF COMPLEX TREATMENT FOR MALIGNANT TUMORS OF THE BRAIN

Osianin A.A.., Centner M.I., Khonina N.A., Leplina O.Yu., Shevela Ye.Yu., Nikonov S.D., Stupak V.V. Ye.R.Chernykh
Institute of Clinical Immunology, Russian Academy of Medical Sciences. Siberian Branch;
Institute of Traumatology and Orthopedics, the Ministry of Health of the RF: Novosibirsk.
The purpose of the present research was to study immunity in the course of complex treatment for malignant gliomas of the brain and to evaluate extracorporeal antigen-specific immunotherapy (EASIT) a pilot procedure which was carried out according to an approved protocol. Initially lowered HLA-DR+ monocyte count and in vitro inhibition of proliferative activity were reported in all patients. Inductive EASIT started in early postoperative period aborted immune disturbances caused by surgery. In 1998-2000, the procedure was performed in 33 patients with anaplastic astrocytoma (AA) (20) and glioblastoma (GB) (13). Mean dose of cell infusion was 2,43±0,18 x 109 /patient and was well tolerated. There are 22 survivors and 9 patients died (GB - 4 and AA - 5; overall mortality - 29 %). Mean relapse-free survival was 14,2 mo (22); stable remission during 12-18 mo. - 37,5 % (3/8) (GB) and 64 % (9/14) (AA). Complete rehabilitation of immunity was generally reported 12 mo. after the course of EASIT. Hence, complex treatment (surgery + EASIT) enhanced its efficacy in the management of brain tumors.