Иглистые мыши способны восстанавливать поврежденный спинной мозг

Рис. 1. Как показано в обсуждаемой работе, иглистые мыши, в частности каирская мышь (Acomys cahirinus), способны к регенерации поврежденного спинного мозга. При его разрыве в районе восьмого грудного позвонка (lesion site at T8) происходит ремоделирование внеклеточного матрикса (ECM remodelling), увеличение количества кератансульфатных протеогликанов (KSPG, keratansulphate proteoglicans), а также повышается уровень фермента b-1,3-N-ацетилглюкозаминтрансферазы 7, который контролирует образование этих молекул. В районе повреждения не накапливаются фибробласты (fibrosis, фиброз) и астроциты (astroglyosis, астроглиоз), а значит не формируется шрам, мешающий восстановлению аксонов нервных клеток. Домовые мыши (Mus musculus) не способны к регенерации подобных повреждений. У них в месте повреждения спинного мозга накапливаются фибробласты и астроциты. Фибробласты (fibroblasts) обозначены оранжевым цветом, астроциты (astrocytes) — зеленым. Рисунок из обсуждаемой статьи в Developmental Cell

Регенерация органов и тканей — задача «со звездочкой» для взрослых особей большинства видов млекопитающих, включая человека. Их организмы способны самостоятельно зарастить не слишком большую рану, но с возрастом даже простые царапины оставляют шрамы. Более серьезные и хронические повреждения приводят к фиброзу — разрастанию нефункциональной соединительной ткани. Но у некоторых млекопитающих есть весьма незаурядные способности к регенерации. Один из примеров — каирские мыши (Acomys cahirinus), относящиеся к иглистым мышам. Они способны не только заживлять кожу, но и полностью восстанавливать поврежденные органы, включая спинной мозг. В недавнем исследовании показано, что это, вероятно, происходит за счет особой организации внеклеточного матрикса, который одновременно препятствует образованию фиброзного шрама и способствует восстановлению функциональных клеток, в частности нейронов.

Полная регенерация органов и тканей — способность многих животных (от губок до амфибий), однако большинство видов млекопитающих способно полноценно регенерировать только отдельные ткани, например выстилку кишечника и печеночную ткань. Даже кожа при достаточно крупных повреждениях (вроде глубокой царапины длиной несколько сантиметров) не восстанавливается полностью: образуется шрам, который менее эластичен и чувствителен, чем настоящая кожа. С более сложными органами дела с точки зрения восстановления обстоят еще печальнее: как правило, поврежденная ткань заменяется на соединительную, которая не может работать так, как это нужно для нормального функционирования органа.

Что происходит при повреждении? В зоне повреждения активируется много клеток разных типов. Если, например, вы внезапно порезали палец, то тромбоциты не только предотвратят кровотечение, но и активируют клетки, запускающие и поддерживающие воспаление. Такие же сигналы этим клеткам посылают поврежденный эпителий и нервные окончания. Тучные клетки и нейтрофилы очищают рану от погибших клеток и попавших в нее бактерий. Миофибробласты (одни из клеток соединительной ткани) начинают выделять белок коллаген, который позволяет ране закрыться. Позже активируются кератиноциты и клетки эпителия, покрывающие рану и формирующие шрам (подробнее об этом процессе см. в обзоре C. D. Marshall et al., 2018. Cutaneous Scarring: Basic Science, Current Treatments, and Future Directions).

В идеале миофибробласты и иммунные клетки должны покинуть место повреждения после восстановления, а внеклеточный матрикс (то есть молекулы, которые обеспечивают поддержку клеток в ткани) в районе повреждения — постепенно восстановиться до нормы. Однако полное восстановление у млекопитающих возможно только при повреждении плода — в этом случае шрамов не образуется. У взрослых млекопитающих кроме исключительных случаев, например восстановления кожи у зимующих барибалов (P. A. Iaizzo et al., 2012. Wound healing during hibernation by black bears (Ursus americanus) in the wild: elicitation of reduced scar formation), шрамы остаются в течение долгого времени или даже навсегда, особенно после крупных повреждений. Рубцовая ткань состоит в основном из коллагена I типа (в отличие от коллагена III типа, который составляет основную часть внеклеточного матрикса кожи).

Шрамы — это не только изменение внешнего вида кожи или другого органа, но и нарушение их функции. Нагромождение волокон коллагена не может заменить ни мышечные клетки, меняя растяжимость таких органов как матка или сердце, ни нейроны спинного и головного мозга, приводя к нарушению когнитивной, двигательной и других функций. В случае, если дополнительные фибробласты, производящие коллаген, не покинули место повреждения ткань шрама может разрастаться и превращаться в опухоли — фибромы.

Но есть млекопитающие, у которых даже во взрослом возрасте повреждения восстанавливаются без образования шрамов. Иглистые мыши (Acomys) — род небольших грызунов, которые живут на Ближнем Востоке, в Южной Азии и Африке. Они получили свое название от жестких волосков на спинке, которые напоминают мелкие иголки, но не очень помогают в защите от хищников. В 2012 году исследователи из США и Кении опубликовали работу, описывающую интересную стратегию защиты от нападения у иглистых мышей (A. W. Seifert et al., 2012. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys)). Оказалось, что при грубом обращении или нападении кожа этих животных с легкостью рвется и отслаивается, позволяя мыши вырваться и оставляя врага ни с чем. Однако, даже после серьезных ран кожа иглистых мышей восстанавливается полностью, включая шерсть, нервные окончания, кожные железы и подлежащую мышечную и жировую ткань (рис. 2).

Рис. 2. Иглистые мыши A. kempi (a) и A. percivali (b). Обратите внимание на жесткие, похожие на иголки волоски на спине животных. c — особь A. kempi после потери кожи на спине. d, e — восстановление кожи. Через 3 дня (d) видны корки на ране, через 30 дней (e) раны полностью заросли. f — на участке с повреждением у пойманной в дикой природе иглистой мыши видны новые жесткие волоски. Длина масштабных отрезков — 1 см. Рисунок из статьи A. W. Seifert et al., 2012. Skin shedding and tissue regeneration in African spiny mice (Acomys)

Похожую стратегию защиты используют сцинки и гекконы, но у них (в отличие от иглистых мышей) кожа имеет особенность — дерма разделена на два слоя: хрупкий наружный слой и более прочный внутренний. Между ними находится слой рыхлой соединительной ткани. Так образуются предварительно сформированные места разрыва (A. M. Bauer et al., 1989. Mechanical Properties and Morphological Correlates of Fragile Skin in Gekkonid Lizards). У иглистых мышей такой особенности нет. Их кожа по составу внеклеточного матрикса похожа на кожу домовых мышей, но менее эластичная, вероятно за счет того, что железы и волосяные луковицы у них больше, чем у мышей. При зарастании раны рубцовая ткань у иглистых мышей состоит в основном из коллагена III, а не коллагена I (как у других млекопитающих), что, возможно, помогает коже регенерировать быстрее, а рубцовой ткани впоследствии исчезать.

Ученые, сравнивающие регенерацию у иглистых и домовых мышей, показали, что у иглистых мышей не так интенсивно идет воспалительный процесс. Провоспалительные факторы и связанные с воспалением клетки (нейтрофилы и некоторые типы макрофагов) менее выражены в ранах иглистых мышей, а факторы, связанные с восстановлением ткани, — наоборот (J. Simkin et al., 2017. Macrophages are necessary for epimorphic regeneration in African spiny mice). Иглистые мыши также могут восстанавливать мышечную ткань после повреждения, а также воздействия миотоксинов (M. Maden, J. O. Brant, 2018. Insights into the regeneration of skin from Acomys, the spiny mouse).

В последние годы ученые выяснили, что и внутренние органы иглистых мышей способны к регенерации. Последней стадией многих форм заболевания почек является тубулоинтерстициальный фиброз, который приводит к полному отказу органа и возможной смерти пациента. Здоровая паренхима почки и почечные канальцы замещаются соединительной тканью. Но если смоделировать такое состояние на иглистых мышах, то у них не формируются фиброзные образования, а поврежденные почечные канальцы сохраняют свою структуру (D. M. Okamura et al., 2021. Spiny mice activate unique transcriptional programs after severe kidney injury regenerating organ function without fibrosis).

А что насчет повреждений нервной системы? Ведь если иглистые мыши способны восстанавливать внутренние органы, то можно предположить, что они могут восстанавливать и, например, спинной мозг. У «обычных» млекопитающих при повреждении спинного мозга активируются иммунные клетки, которые вызывают воспаление (в том числе и микроглия). Астроциты и стромальные клетки спинного мозга выделяют внеклеточные белки (например коллаген IV), которые образуют фиброзный шрам (G. M. Cregg et al., 2014. Functional regeneration beyond the glial scar). Такой шрам — это физический и химический барьер для восстановления поврежденных аксонов.

В 2019 году вышла первая работа, посвященная поискам ответа на этот вопрос (K. A. Streeter et al., 2019. Molecular and histologic outcomes following spinal cord injury in spiny mice, Acomys cahirinus). Ее авторы повреждали спинной мозг иглистых и домовых мышей с помощью сдавливания — такая операция имитирует наиболее распространенную у человека травму спинного мозга. Уже через пару дней иглистые мыши показывали признаки восстановления функции мочевого пузыря: они могли самостоятельно его опорожнять. Домовым мышам при этом требовалась помощь техников вивария. Через три дня после повреждения у домовых мышей по сравнению с иглистыми были более активными гены, которые связаны с образованием раны (воспалением и изменением ткани). У иглистых мышей же активировались гены, продукты которых участвуют в восстановлении нервных клеток (рис. 3).

Рис. 3. Восстановление спинного мозга домовых и иглистых мышей после сдавливания. У домовых мышей (a–c) наблюдается накопление коллагена IV (ColIV, красный цвет) в районе повреждения, тогда как у иглистых мышей (d–f) скапливается основный белок миелина (MBP, myelin basic protein, зеленый цвет). a и d — продольные срезы спинного мозга; b, c, e, f — увеличенные изображения места повреждения. Синим цветом окрашены ядра (DAPI). Рисунок из статьи K. A. Streeter et al., 2019. Molecular and histologic outcomes following spinal cord injury in spiny mice, Acomys cahirinus

При микроскопическом исследовании оказалось, что на месте повреждения у иглистых мышей не накапливается коллаген IV, который образует большую часть шрама. Зато у них (но не у домовых мышей) там присутствует основный белок миелина (MBP, myelin basic protein). Этот белок участвует в регенерации аксонов (Z. Yan et al., 2021. Myelin basic protein enhances axonal regeneration from neural progenitor cells).

Исследования регенерации у иглистых мышей продолжаются, и в февральском номере журнала Developmental Cell вышла статья, в которой показано, что иглистые мыши способны регенерировать не просто поврежденный, а перерезанный спинной мозг. После операции по перерезанию спинного мозга за мышами наблюдали в течение 8 недель. Их восстановление оценивали по шкале Бассо для мышей (D. M. Basso et al., 2006. Basso Mouse Scale for Locomotion Detects Differences in Recovery after Spinal Cord Injury in Five Common Mouse Strains): 0 — голеностоп не двигается, 9 — полная мобильность. У домовых мышей даже через 8 недель индекс не доходил до 1. У иглистых мышей уже через две недели индекс в среднем достигал значения 2 (двигался голеностоп), а через 8 недель средний индекс составлял 4 (мыши могли стоять, используя задние лапы). 8 из 14 подопытных иглистых мышей через 8 недель могли не только стоять, используя все четыре лапы, но и ходить.

Кроме того, иглистые мыши могли контролировать работу мочевого пузыря уже через 3 недели, тогда как у домовых мышей наблюдалось недержание мочи и ее задержка в мочевом пузыре. Таким образом, иглистые мыши — практически беспрецедентный пример взрослого млекопитающего, которое может восстановить поврежденный спинной мозг.

Рис. 4. a — иглистая мышь (Acomys cahirinus). b — план эксперимента: домовых и иглистых мышей в течение 1 недели готовили к эксперименту (habituation), затем повреждали спинной мозг (SCI, spinal cord injury). В течение 8 недель после операции за животными наблюдали, оценивая их восстановление по шкале Бассо, а также то, как животные владели мочевым пузырем. После этого животных подвергали эвтаназии (euthanasia). с — двигательная активность домовой и иглистой мыши через 8 недель после операции. d — оценка восстановления по шкале Бассо (BMS score). Домовые (темно-серые кружочки, Mus sham) и иглистые мыши (темно-голубые кружочки, Acomys sham), которым провели фиктивное хирургическое вмешательство (операцию провели, но не перерезали спинной мозг), получали максимальные баллы по шкале. Светло-серыми кружочками показаны значения для мышей после травмы (Mus SCI), светло-голубыми квадратиками — для иглистых мышей (Acomys SCI). На 8 неделе эксперимента части иглистых мышей повторно перерезали спинной мозг (2x injury), чтобы показать, что именно восстановление спинного мозга приводит к восстановлению подвижности. e — доля животных, которые восстановили контроль над мочевым пузырем (% of animals with bladder control). f — мочевые пятна домовых (Mus) и иглистых (Acomys) мышей после повреждения спинного мозга (SCI) или фиктивной операции (sham). Обратите внимание на мелкие пятна и брызги мочи у домовых мышей после повреждения спинного мозга — они свидетельствуют о том, что травмированные мышки не контролируют мочеиспускание. Рисунок из обсуждаемой статьи в Developmental Cell

В чем же секрет иглистых мышей? Через 8 недель на месте повреждения у домовых мышей образовался большой шрам, выходящий за контур обычного спинного мозга. У иглистых мышей шрам был гораздо меньшего размера. В ткани шрама у домовых мышей совсем отсутствовали признаки роста новых аксонов (у них аксоны вообще втягивались назад). У иглистых мышей через ткань шрама, наоборот, протягивались восстанавливающиеся аксоны.

В спинном мозге проходят восходящие и нисходящие нервные пути. Первые несут информацию от органов и тканей, вторые доставляют в них информацию. Исследователи обнаружили, что восстанавливаются аксоны обоих типов путей, причем они образовывали синапсы и в них наблюдалась проводимость.

Конечно же, у такой экстраординарной регенерации должны быть какие-то молекулярные причины. Чтобы их выявить, авторы сравнили гены, которые экспрессируются на месте повреждения у домовых и иглистых мышей. Самые большие отличия были в сигнальных путях, связанных с воспалением, а также активностью ферментов ацетилглюкозаминтрансфераз. То, что у иглистых мышей снижается активность воспалительных процессов, было показано другими авторами. Однако изменение работы ацетилглюкозаминтрансфераз — это очень интересная находка. Такие ферменты влияют на синтез основных гликозаминогликанов — полисахаридов, которые, присоединяясь к белкам, образуют протеогликаны, составляющие большую часть внеклеточного матрикса. В частности, у иглистых мышей изменялся уровень ферментов, которые влияют на образование кератансульфатных и гепарансульфатных протеогликанов. Уровень b-1,3-N-ацетилглюкозаминтрансферазы 7, необходимой для синтеза кератансульфатных протеогликанов, рос на месте повреждения, тогда как уровень N-деацетил-N-сульфотрансфераз 3 и 4, модифицирующих уже сформированные гепарансульфатные протеогликаны, наоборот падал. Зачем же нужны такие изменения?

Синтезированная на месте повреждения b-1,3-N-ацетилглюкозаминтрансфераза 7 создает накопление кетанатсульфатных протеогликанов по обе стороны от места повреждения. Как и предполагалось, уровень гепарасульфатных протеогликанов наоборот снижался. Такие изменения в составе внеклеточного матрикса и могли повлиять на восстановление аксонов. Однако напрямую это проверить сложно, так как требуются генетические манипуляции с целыми животными. Поэтому авторы использовали альтернативную методику. Они получили клетки китайского хомячка линии CHO, которые производили b-1,3-N-ацетилглюкозаминтрансферазу 7 иглистых мышей, а затем выращивали на этих клетках нейроны ганглиев задних корешков и коры головного роста мышей. У нейронов обоих типов по сравнению с контролем отростки (дендриты и аксоны) росли более эффективно на таких модифицированных клетках (рис. 5).

Рис. 5. Внеклеточный матрикс влияет на восстановление нейронов. a — продольный разрез повреждения спинного мозга у домовых мышей (Mus) и иглистых мышей (Acomys) через 8 недель после повреждения. Ткань окрашена антителами к кератансульфатным протеогликанам (KSPG). Белые стрелки указывают на отложение этих молекул в районе повреждения. Чтобы выявить присутствие кератансульфатных протеогликанов, образцы ткани также инкубировали с кератаназой (Keratanase), разрушающий эти молекулы. Интенсивность сигнала KSPG снижалась. b — соответствующие численные данные. с — продольный разрез повреждения спинного мозга у домовых мышей (Mus) и иглистых мышей (Acomys) через 8 недель после повреждения. Ткань окрашена антителами к гепарансульфатированным протеогликанам (HSPG). Чтобы выявить присутствие гепарансульфатированных протеогликанов, образцы также инкубировали с гепариназой III (Heparinase), разрушающий эти молекулы. Интенсивность сигнала HSPG снижалась. d — соответствующие численные данные. e — схема эксперимента по влиянию b-1,3-N-ацетилглюкозаминтрансферазы 7 на рост отростков нейронов. Зеленым цветом обозначены клетки линии CHO, экспрессирующие этот фермент (Transfected CHO cells); черным цветом обозначены нейроны ганглиев задних корешков и коры головного роста мышей (Mus DRG or cortical neurons). В первый день эксперимента высаживали клетки CHO, трансфекцию (внесение ДНК, кодирующей ген b-1,3-N-ацетилглюкозаминтрансферазы 7 (B3gnt7-GFP) или зеленого флуоресцентного белка (GFP)) проводили на третий день. На шестой день на эти клетки высаживали нейроны, а на седьмой день эксперимент останавливали и замеряли длину их отростков. f — типичный вид нейронов на клетках CHO, экспрессирующих B3gnt7-GFP или GFP. Желтым цветом обозначен β-тубулин III — маркер растущих нервных отростков. g, h, i — графики общей длины отростков нейронов (total neurite length), длины аксонов (axon length) и числа разветвлений (n of braches) к расстоянию до тела клетки (distance from soma); длины измерялись в мкм. Рисунок из обсуждаемой статьи в Developmental Cell

Таким образом, вероятный секрет регенерации иглистых мышей — устройство внеклеточного матрикса и его ответ на повреждения. Безусловно, это не единственный фактор — роль контроля за воспалением сложно недооценить. Однако, внеклеточный матрикс остается малоизученным элементом этого процесса. Его устройство, безусловно, организует процесс, обеспечивает правильное микроокружение для прибывающих клеток, способствует обмену химическими веществами между ними. Но эти взаимоотношения настолько сложные, что ученым еще долго предстоит с ними разбираться. Интересно, что результаты данного исследования противоречат предыдущим публикациям, в которых утверждалось, что кератансульфатные протеогликаны снижают интенсивность регенерации аксонов (S. Imatama et al., 2011. Keratan Sulfate Restricts Neural Plasticity after Spinal Cord Injury).

Интересно еще и то, почему и как именно иглистые мыши, а не домовые или, скажем, их близкие родственники песчанки приобрели такие удивительные способности к регенерации. Возможно, когда-нибудь мы получим на него ответ.

Источник: J. Nogueira-Rodrigues, S. C. Leite, R. Pinto-Costa, S. C. Sousa, L. L. Luz, M. A. Sintra, R. Oliveira, A. C. Monteiro, G. G. Pinheiro, M. Vitorino, J. A. Silva, S. Simão, V. E. Fernandes, J. Provazník, V. Benes, C. D. Cruz, B. V. Safronov, A. Magalhães, C. A. Reis, J. Vieira, C. P. Vieira, G. Tiscórnia, I. M. Araújo, M. M. Sousa. Rewired glycosylation activity promotes scarless regeneration and functional recovery in spiny mice after complete spinal cord transection // Developmental Cell. 2022. DOI: 10.1016/j.devcel.2021.12.008.

Екатерина Грачева