Методом искусственной эволюции создан новый фермент для редактирования геномов

Рис. 1. Редактирование оснований (base editing): замена комплементарной пары нуклеотидов A∙T на G∙C без внесения двойных разрывов в геномную ДНК. a — из 32 000 известных человеческих однонуклеотидных замен с патологическими эффектами почти половина (48%) исправляется путем замены A∙T на G∙C. b — заменить A∙T на G∙C можно путем дезаминирования аденина (А). При этом аденин превращается в инозин (I), который «читается» ферментами-полимеразами как гуанин (G). c — схема работы молекулярного устройства для замены A∙T на G∙C без двойных разрывов ДНК. Устройство состоит из мутантного белка Cas9, не способного делать двойные разрывы, но умеющего разрезать одну из двух цепей ДНК (Cas9 nickase, показан синим цветом), направляющей, или гидовой, РНК (sgRNA, показана зеленым цветом), нуклеотидная последовательность которой соответствует тому участку геномной ДНК (Genomic DNA), который нужно отредактировать (Protospacer), и фермента, способного дезаминировать аденины в ДНК (Hypotetical deoxyadenosine deaminase, показан красным цветом). Этот комплекс присоединяется к нужному участку геномной ДНК, Cas9 расплетает двойную спираль и надрезает одну из нитей, а фермент аденозиндезаминаза превращает аденин в инозин на другой нити. После этого происходит репарация (починка) надрезанной нити, в ходе которой напротив инозина ставится цитозин (C). При последующей репликации напротив цитозина будет поставлен гуанин (G). Таким образом, пара A∙T превращается в G∙C. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Методы редактирования геномов, разработанные на основе системы CRISPR-Cas, предполагают разрезание обеих цепей геномной ДНК с последующей починкой двойных разрывов, что чревато ошибками. Альтернативный подход — «редактирование оснований» (base editing) — состоит в химической модификации нуклеотидов без создания двойных разрывов. Уже разработан метод превращения пар C∙G в T∙A при помощи фермента цитозиндезаминазы, присоединенного к модифицированному белку Cas9. Для обратного превращения (T∙A в C∙G) нужен фермент аденозиндезаминаза. Проблема в том, что ни одна из известных аденозиндезаминаз не умеет работать с ДНК. Биоинженеры из Гарвардского университета преодолели это препятствие, создав необходимый фермент при помощи искусственной эволюции. Благодаря этому возможности «редактирования оснований» резко расширились: теперь можно с высокой точностью и с минимумом побочных эффектов осуществлять в живых клетках все четыре транзиции, то есть нуклеотидные замены C→T, G→A, A→G и T→C.

«Элементы» не раз рассказывали о системе CRISPR-Cas, отвечающей за наследуемый приобретенный иммунитет у бактерий и архей, и о том технологическом прорыве в области редактирования геномов, который был порожден ее открытием (подробнее см. в новости Подведены итоги первого десятилетия изучения CRISPR, «Элементы», 13.07.2017).

Наиболее популярные сейчас системы редактирования геномов основаны на комбинации белка Cas9 с короткой направляющей, или гидовой, РНК (gRNA). Этот комплекс присоединяется к геномной ДНК там, где последовательность нуклеотидов совпадает с последовательностью gRNA. Таким образом, синтезируя gRNA с разными последовательностями, можно направить Cas9 к тому участку геномной ДНК, который мы хотим отредактировать. Дальше возможны варианты. Исходный, «дикий» вариант Cas9 разрезает обе нити двойной спирали ДНК в указанном месте. После этого клеточные системы репарации ДНК пытаются залатать двойной разрыв, при возможности используя гомологичные фрагменты ДНК в качестве матрицы для восстановления поврежденного участка. Можно ввести в клетку искусственную матрицу и таким образом добиться нужных изменений в репарируемой последовательности.

Однако процесс залечивания двойных разрывов чреват ошибками (в частности, нередко возникают незапланированные вставки и выпадения нуклеотидов — инделы, см. Indel). Поэтому ученые пытаются найти более аккуратные способы редактирования геномной ДНК, не связанные с созданием двойных разрывов. Для этого используют мутантный вариант Cas9 с никазной активностью (никаза — фермент, разрезающий только одну из двух нитей двойной спирали; см. Nickase). На этой основе был разработан метод «редактирования оснований» (base editing), позволяющий аккуратно заменять комплементарную пару оснований C∙G на T∙A. Для этого к мутантному Cas9 при помощи «мостика» из нескольких аминокислотных остатков пришивают фермент цитидиндезаминазу (см. Cytidine deaminase). Этот фермент превращает цитозин (C) в урацил (U), который при транскрипции и репликации «читается» ферментами-полимеразами как тимин (T). Вторая, комплементарная нить ДНК надрезается белком Cas9, и в ходе починки (репарации) этой нити напротив урацила ставится аденин (А). Техническая трудность состоит в том, что урацила в норме не должно быть в составе ДНК. Ферменты репарации внимательно следят за тем, чтобы никаких урацилов в ДНК не было, а в случае их обнаружения пытаются вырезать «бракованный» фрагмент и выстроить его заново на матрице комплементарной цепи ДНК. Поэтому для того, чтобы система «редактирования оснований» исправно работала, к ней приделывают еще один компонент — ингибитор фермента, вырезающего урацилы из ДНК.

Таким образом, на сегодняшний день уже существует молекулярная конструкция, позволяющая довольно аккуратно менять в геноме комплементарные пары C∙G на T∙A. Но вот обратную замену (T∙A на C∙G) столь же аккуратно и без двойных разрывов до сих пор делать не умели. Между тем именно такая замена необходима для исправления 48% известных человеческих однонуклеотидных полиморфизмов с патологическими эффектами (рис. 1, а). Дело в том, что мутация C→T возникает чаще других из-за спонтанного дезаминирования цитозина, а системам репарации не всегда удается ее вовремя исправить.

Данный пробел восполнили специалисты по «редактированию оснований» из Гарвардского университета (США); предварительная версия их статьи опубликована на сайте журнала Nature 25 октября.

Главная трудность, которую им нужно было преодолеть, состояла в отсутствии в природе ферментов, способных дезаминировать аденины в ДНК. Если бы такой фермент существовал, его можно было бы использовать для создания системы, подобной той, что разработана для превращения C∙G в T∙A. Принцип работы такой системы показан рис. 1, c. Дезаминирование аденина превращает его в инозин (I), который «читается» полимеразами как гуанин (G). Однако все известные аденозиндезаминазы работают не с ДНК, а с РНК или с отдельными нуклеотидами, не входящими в состав полимерной цепочки. Например, у кишечной палочки Escherichia coli есть фермент TadA — аденозиндезаминаза, которая работает с одноцепочечной РНК, превращая A в I в антикодоне аргининовой транспортной РНК.

Для начала авторы, понадеявшись на удачу, попробовали просто взять разработанную ранее конструкцию для превращения C∙G в T∙A и заменить в ней цитозиндезаминазу на одну из природных аденозиндезаминаз. Модифицированную конструкцию внедряли в культуру человеческих клеток HEK293T (см.: HEK 293 cells) вместе с гидовой РНК, которая направляла Cas9 к определенному месту в геноме человеческой клетки. После этого проверяли, не заменилась ли в указанном месте пара T∙A на C∙G.

Авторы перепробовали четыре аденозиндезаминазы (одну мышиную, две человеческие и одну бактериальную — упомянутую выше TadA), но ничего не вышло. Стало ясно, что природные аденозиндезаминазы не годятся для редактирования ДНК. Это, однако, не остановило исследователей. Фермент, который не позаботилась создать естественная эволюция, они решили получить при помощи эволюции искусственной.

Для этого были изготовлены модифицированные бактерии E. coli с дефектными генами устойчивости к антибиотикам. В эти гены были внесены точечные мутации, нарушающие работу защитного белка и представляющие собой замены C на Т или G на A. Чтобы исправить такую мутацию и восстановить работоспособность защитного белка, необходимо заменить комплементарную пару T∙A на C∙G.

Затем в этих бактерий внедряли плазмиды, кодирующие прототип молекулярного устройства для редактирования аденинов: белок Cas9 (лишенный способности создавать разрывы в ДНК) с пришитой к нему аденозиндезаминазой TadA. В ген TadA предварительно вносились разнообразные случайные мутации. В те же плазмиды был вставлен и ген гидовой РНК, которая должна была направить «редактор аденинов» к нуждающемуся в редактировании участку гена защитного белка.

После этого бактерий подвергали воздействию антибиотика. Идея была в том, что клетки, в которых «редактор аденинов» сработает, выживут, а все прочие погибнут. Это позволит найти такие мутации TadA, которые позволяют этому ферменту дезаминировать аденины в ДНК хотя бы с самой минимальной эффективностью.

Первый раунд искусственной эволюции выявил две аминокислотные замены, придающие TadA способность изредка превращать аденины в инозины в геноме бактерии. Конструкция, включающая TadA с этими двумя заменами, получила название ABE1.2 (adenine base editor, версия 1.2). Конструкцию испытали на человеческих клетках HEK293T. При этом к ней добавили сигнал ядерной локализации, чтобы химерный белок доставлялся в ядро, а также использовали вариант Cas9 с никазной активностью, который лучше подходит для работы с эукариотической ДНК. Использовались гидовые РНК, направляющие «редактор аденинов» к шести разным точкам человеческого генома.

В результате целевые пары T∙A заменились на C∙G в 3,2% случаев. Результат может показаться не слишком впечатляющим, но это было только начало работы. Последовали новые раунды искусственной эволюции, позволившие значительно усовершенствовать «редактор аденинов». Отбор каждый раз проводился на бактериях (причем менялись как защитные гены и антибиотики, так и мутации в защитных генах, которые нужно было отредактировать), а тестирование — на человеческих клетках.

Между раундами отбора авторы использовали «разумный дизайн», анализируя полученные результаты и пытаясь придумать, как еще можно повысить эффективность редактора. Некоторые пути оказались тупиковыми. Например, выяснилось, что инозины, появляющиеся в геномной ДНК, почти полностью игнорируются системами репарации (в отличие от урацилов), поэтому добавление в систему дополнительных средств для защиты инозинов от репарации ничего не дает. Зато другая идея — добавить в конструкцию вторую копию TadA — оказалась плодотворной. По-видимому, дело в том, что природный TadA работает с однонитевой РНК в виде гомодимера — комплекса из двух одинаковых белковых молекул. Одна из них «держит» РНК, а другая дезаминирует аденин. Судя по всему, модифицированному TadA работать с однонитевой ДНК тоже удобнее в виде димера. Сначала авторы использовали две одинаковые копии TadA, но потом обнаружили, что лучше в качестве второй копии использовать TadA дикого типа, а изменения, повышающие эффективность работы с ДНК, вносить только в первую копию.

Рисунок 2 отражает поэтапное совершенствование «редактора аденинов» в ходе чередующихся раундов искусственной эволюции и разумного дизайна. В конце концов была получена продвинутая версия ABE7.10, справляющаяся с заменой T∙A на C∙G в среднем в 53% случаев и довольно редко «промахивающаяся», то есть редактирующая другие аденины помимо (или вместо) целевого. Редактор аденинов ABE7.10 неплохо справляется даже с такими сложными случаями, как изменение аденина, расположенного по соседству с другими аденинами (для этого потребовались дополнительные раунды отбора, в которых выживание бактерий зависело именно от этой способности редактора).

Рис. 2. Поэтапное усовершенствование TadA в ходе создания аденозиндезаминазы, способной работать с ДНК. Слева — номера версий «редактора аденинов», от исходной ABE1.0 до наиболее продвинутой ABE7.10. Числа в верхнем ряду — аминокислотные позиции, в которых происходили замены. Третья колонка справа показывает, сколько копий TadA входило в конструкцию и были ли эти копии одинаковыми (Homodimer) или разными (Heterodimer). Последние две колонки — длины «мостиков», связывающих Cas9 и две копии TadA. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Для пущей наглядности авторы продемонстрировали успешное редактирование некоторых реальных человеческих полиморфизмов, связанных с теми или иными патологиями. Например, две мутации в промоторах генов гамма-глобинов HBG1 и HBG2 обеспечивают производство фетального гемоглобина у взрослых людей. Это бывает полезно при нарушениях работы бета-глобина (HBB), в том числе при серповидноклеточной анемии. При помощи редактора аденинов ABE7.10 удалось внести в геном клеток HEK293T обе эти условно-полезные мутации с эффективностью 29% и 30%.

Дополнительные эксперименты показали, что точность и надежность работы ABE7.10 существенно выше, чем у других методов редактирования генома, предполагающих создание двойных разрывов ДНК. Впрочем, последние всё равно остаются оптимальным выбором, если нужно внести в геном делецию или вставку нуклеотида. Но для аккуратной замены одного пуринового основания на другое (А на G или G на A), равно как и для замены пиримидиновых оснований друг на друга (C на T или T на C), оптимальным средством теперь, по-видимому, следует считать разработанные авторами «редакторы оснований». Они теперь позволяют при помощи химического редактирования, без внесения двойных разрывов, осуществлять все четыре транзиции (точечных замены пиримидина на другой пиримидин или пурина на другой пурин; см. Transition), то есть нуклеотидные замены C→T, G→A, A→G и T→C.

Даже самым эффективным и точным современным методам редактирования генома еще далеко до стопроцентной эффективности и абсолютной точности. Но если вспомнить, что с момента расшифровки системы CRISPR-Cas прошло всего-навсего десять лет, то достигнутый прогресс не может не впечатлять. Обсуждаемая работа представляет собой важный шаг на пути к созданию геномных редакторов, достаточно надежных для того, чтобы использовать их для лечения наследственных заболеваний.

Источник: Nicole M. Gaudelli, Alexis C. Komor, Holly A. Rees, Michael S. Packer, Ahmed H. Badran, David I. Bryson & David R. Liu. Programmable base editing of A∙T to G∙C in genomic DNA without DNA cleavage // Nature. Published online 25 October 2017. DOI: 10.1038/nature24644.

См. также:
1) Подведены итоги первого десятилетия изучения CRISPR, «Элементы», 13.07.2017.
2) Константин Северинов. Редактирование генома с CRISPR/Cas9 («Постнаука»).

Александр Марков