ВЫПУСК 109

Новая система адресной доставки лекарственных препаратов подтверждает свою эффективность

Загруженная противораковым препаратом система адресной доставки, основанная на новом материале, названном наногубкой, задерживает рост раковой опухоли в три-пять раз эффективнее, чем обычные инъекции.

Такой вывод делается в статье, опубликованной в журнале Cancer Research.

«Эффективные системы адресной доставки лекарственных препаратов уже давно являются мечтой, но эта мечта в значительной степени не реализуется из-за сложной химии, задействованной в таких системах», - говорит Ева Харт (Eva Harth), доцент химии из Университета Вандербильта (Vanderbilt University), разработавшая систему доставки с помощью наногубки. «Мы сделали значительный шаг вперед в преодолении этих препятствий».

Лаборатория Харт проводила свое исследование в сотрудничестве с лабораторией Дэнниса Халлахана (Dennis E. Hallahan), бывшего профессора радиационной онкологии Университета Вандербильта, а ныне профессора Медицинской школы Университета Вашингтона (Washington University).

Чтобы понять, как работает система доставки, разработанная Харт, представьте себе крошечные, размером с вирус, наполненные лекарственным препаратом губки, к которым прикреплены специальные химические линкеры, преимущественно связывающиеся со структурами, находящимися только на поверхности опухолевых клеток. Такие губки вводятся в организм инъекционным путем. Они циркулируют в организме с током крови до тех пор, пока не встретятся с раковой клеткой. В результате они либо «прилипают» к ее поверхности, либо всасываются внутрь клетки, начиная контролируемо и предсказуемо выделять свой груз.

Системы адресной доставки такого типа имеют несколько основных преимуществ: так как лекарственный препарат выделяется только вблизи опухоли и не циркулирует по всему организму, данная доза становится более эффективной. Наблюдается также меньшее количество побочных эффектов, так как в непосредственном контакте со здоровыми тканями находится меньшее количество токсичных препаратов.

«Мы назвали наш материал наногубкой, но на самом деле он скорее похож на трехмерную сеть», - говорит Харт. «Его основой являются длинные цепочки полиэстера. Такие цепочки мы смешиваем в растворе с маленькими молекулами, называемыми кросс-линкерами, которые действуют как крошечные крючочки, скрепляющие вместе различные части полимера». В конечном итоге формируются сферические частицы с внутренней полостью, в которую можно поместить молекулы лекарственного вещества. Полиэстер - биоразлагаемый полимер и постепенно распадается в организме. По мере того, как это происходит, находящийся в частице препарат выделяется из нее полностью предсказуемым образом.

«Предсказуемое выделение препарата – одно из главных преимуществ этой системы доставки по сравнению с другими разрабатываемыми сейчас системами, доставляющими препараты с помощью наночастиц», - утверждает Харт. Когда наночастицы достигают своей цели, многие системы выделяют свой груз быстро и неконтролируемо. Это называется взрывным эффектом, и в таком случае трудно определить эффективные дозы препарата.

Другим важным преимуществом является то, что губчатые наночастицы являются растворимыми в воде. Инкапсуляция противораковых препаратов в структуру наногубки позволяет использовать плохо растворимые гидрофобные препараты. В настоящее время такие препараты нужно смешивать с другими химическими веществами, называемыми адъювантами, что снижает эффективность самого лекарственного средства и может привести к неблагоприятным побочным эффектам.

Кроме того, размер губчатых наночастиц можно контролировать. Изменяя соотношение кросс-линкеров и полимера, можно сделать частицы больше или меньше. Это важно, так как исследование показало, что адресные системы доставки работают наиболее эффективно, если частицы имеют размер меньше 100 нанометров. Частицы, использовавшиеся в данном исследовании, имели размер 50 нанометров. «Взаимосвязь между размером частицы и эффективностью нашей системы доставки является предметом активного изучения», - говорит Харт.

Еще одним преимуществом системы Харт является ее химическая простота. Исследователи разработали простые и эффективные методы получения наночастиц и связывания с ними линкеров, представляющих собой пептиды, относительно небольшие биологические молекулы, состоящие из аминокислот. «Многие другие системы доставки препаратов требуют применения сложных химических веществ, что затрудняет их производство в промышленном масштабе, и мы постоянно имели это в виду», - подчеркивает Харт.

Пептид-лиганд, используемый в экспериментах на животных, был разработан в лаборатории Халлахана, где также проверялась эффективность всей системы на опухолях у мышей. Пептид, используемый в данном исследовании, селективно связывается с опухолями, подвергшимися воздействию облучением.

Препаратом, использованным в экспериментах на животных, был паклитаксель (Таксол), применяемый в химиотерапии рака. Ученые зафиксировали реакцию двух различных типов опухолей – медленно растущей опухоли молочной железы человека и быстро развивающейся глиомы мышей – на одну инъекцию. В обоих случаях они обнаружили, что она увеличивает гибель раковых клеток и задерживает рост опухоли, «превосходя по эффективности известные химиотерапевтические подходы».

Следующим шагом в исследованиях станет проведение экспериментов с повторными инъекциями, чтобы убедиться, можно ли с помощью наногубки полностью остановить рост опухоли и обратить его вспять. Харт также собирается провести более полное токсикологическое исследование своей системы, которое требуется перед клиническими испытаниями.

Иллюстрация частицы наногубки. Красные овалы представляют груз лекарственного препарата, который несет частица. Прикрепленные к поверхности частицы пептиды, связывающие ее с поверхностью опухоли, показаны в виде условных химических символов.

Частица наногубки, закрепившаяся на клетках опухоли молочной железы человека. Частица содержат противораковый препарат, который выделяется по мере ее разложения. Пептидные линкеры показаны в виде групп шаров, прикрепившихся к клеткам. Хотя на рисунке показаны только два линкера, фактически на поверхности настоящей наночастицы находится около трех десятков пептидов. Линкеры специально сконфигурированы для связывания с поверхностью облученных раковых клеток.

Аннотация к статье: Dennis E. Hallahan, Eva Harth, Roberto Diaz et al. Targeted Nanoparticles That Deliver a Sustained, Specific Release of Paclitaxel to Irradiated Tumors

Оригинал статьи

Nanosponge drug delivery system more effective than direct injection

Источник: NANO NEWS NET

Мониторинг глюкозы в крови с помощью углеродных нанотрубок

Чтобы всегда знать уровень сахара в крови, люди, страдающие диабетом I типа, вынуждены прокалывать себе пальцы по несколько раз в день. Хотя боль при такой манипуляции незначительна, это мешает повседневной жизни.

«Им никогда не избавиться от этой процедуры», - говорит Пол Бэрон (Paul Barone), научный сотрудник отделения химического машиностроения Массачусетского технологического института (Massachusetts Institute of Technology – MIT). Бэрон и профессор Майкл Страно (Michael Strano) работают сейчас над новым типом прибора для мониторинга уровня глюкозы в крови, который не только избавит больных от этой неприятной процедуры, но и обеспечит более точные результаты.

«Сахарный диабет – огромная проблема, носящая глобальный характер, и, несмотря на значительные инженерные достижения, наши возможности точно измерять уровень глюкозы все еще остаются весьма примитивными», - говорит Страно. «Между тем, для все большего числа людей это является вопросом жизни и смерти».

«Наиболее проблемные последствия диабета развиваются в результате относительно коротких подъемов сахара в крови пациента, превышающих нормальный физиологический уровень, например, после еды», – говорит Страно. «Если мы сможем определять и предотвращать такие подъемы, мы продвинемся далеко вперед в ослаблении разрушительного воздействия этого заболевания».

Исследование, опубликованное в 2008 году в журнале New England Journal of Medicine (NEJM), подтвердило, что непрерывный мониторинг помогает пациентам с диабетом I типа в возрасте от 25 лет лучше контролировать уровень глюкозы в крови. Однако существующие портативные устройства не так точны, как тесты, проводимые с помощью прокола пальца, и нуждаются в настройке один-два раза в день – то есть в процессе, который по-прежнему сводится все к той же неприятной процедуре.

Большинство существующих датчиков для непрерывного контроля глюкозы работают на методе введения фермента глюкозоксидазы, расщепляющего глюкозу. Электрод, расположенный на коже, взаимодействует с побочным продуктом реакции - перекисью водорода, позволяя косвенно измерять уровень глюкозы. Однако ни один из таких датчиков не был одобрен для использования в течение более 7 дней подряд.

Профессор педиатрической эндокринологии Стэнфордской школы медицины (Stanford School of Medicine) Брюс Бакингем (Bruce Buckingham), автор вышеупомянутой статьи в NEJM, считает, что мониторинг глюкозы сегодня, безусловно, ориентирован на разработку портативных сенсоров. Однако до того как такие устройства смогут работать без резервного контроля с прокалыванием пальца, пройдет еще несколько лет. «С течением времени такие устройства должны становиться все меньше, точнее и удобнее для ношения», - говорит Бакингем, не принимавший участия в проекте MIT.

Описанная в декабре 2009 года в ACS Nano технология, на которой основан новый сенсор, принципиально отличается от применяемой в существующих сейчас приборах. Сенсор основан на углеродных нанотрубках, заключенных в полимер, чувствительный к концентрации глюкозы. При взаимодействии с глюкозой нанотрубки флуоресцируют, что определяется при освещении их ближним инфракрасным светом. При этом интенсивность флуоресценции коррелирует с концентрацией глюкозы.

Исследователи собираются сделать из таких взвешенных в солевом растворе нанотрубок «чернила», которые можно вводить под кожу, как татуировку. Такая «татуировка» будет работать в течение определенного периода времени, возможно, до шести месяцев, после чего операцию нужно будет повторять.

Для чтения результатов пациент должен носить монитор, освещающий татуировку светом ближней инфракрасной области спектра и определяющий интенсивность возникающей в ответ на освещение флуоресценции. В отличие от многих флуоресцентных молекул, углеродные нанотрубки не разрушаются под воздействием света, что является одним из преимуществ этого типа сенсоров. «Их можно освещать, сколько угодно, причем интенсивность освещения также не имеет значения», - комментирует Бэрон. Благодаря этому датчик может использоваться для непрерывного чтения результатов.

Сейчас Бэрон и Страно работают над улучшением точности своего прибора. Любой датчик уровня глюкозы должен пройти тест, известный как Шкала ошибок Кларка (Clarke Error Grid) – золотой стандарт точности таких устройств. Получаемые с помощью нового сенсора результаты должны точно соответствовать результатам стандартных лабораторных исследований, так как ошибки в определении уровня глюкозы могут оказаться фатальными для пациента.

До начала клинических испытаний нашего датчика пройдет еще несколько лет, отмечает Бэрон, но эксперименты на животных начнутся в ближайшем будущем.

«Они станут ключевыми для определения ценности этого подхода», - считает Бакингем. «Пока сенсор ни на ком не испытан и пока не оценена интенсивность сигнала, ничего нельзя сказать о том, насколько хорош сам подход».

Оригинал статьи

‘Tattoo’ may help diabetics track their blood sugar

В лабораториях ученых

Искусственная поджелудочная железа отслеживает два гормона

Процесс управления диабетом I типа – своего рода подвиг организованности и самоконтроля. Чем лучше больному диабетом удается удерживать количество сахара в крови на должном уровне, тем менее вероятны возникающие с течением времени осложнения этого заболевания. Но даже с такими устройствами, как автоматические помпы, непрерывно выделяющими определенную дозу инсулина, больные должны постоянно помнить о необходимости его дополнительного введения во время приема пищи, и многим в течение дня приходится тратить значительное количество времени на дополнительное регулирование уровня своего сахара, который становится то выше, то ниже физиологической нормы.

Ученые уже занимаются разработкой системы «искусственной поджелудочной железы», способной контролировать уровень глюкозы в крови и приводить его к норме в автоматическом режиме, без какого-либо вмешательства человека. Предварительные клинические испытания, подробно описанные в Science Translational Medicine, знаменуют собой значительный прогресс в создании полностью автоматизированной системы. Устройство продемонстрировало свою способность контролировать уровень сахара у небольшой группы больных диабетом, даже если они принимали богатую углеводами пищу, что является самой сложной задачей для искусственных систем, имитирующих поджелудочную железу.

Большинство разрабатываемых сейчас подобных систем сочетают в себе монитор уровня сахара с инсулиновой помпой. К устройству, испытываемому в данном исследовании, добавлен еще один компонент – монитор гормона глюкагона, антагониста инсулина. Глюкагон позволяет предотвратить чрезмерное падение уровня сахара в крови в случае введения слишком большой дозы инсулина. И хотя у больных диабетом вырабатывается свой глюкагон, он не всегда функционирует должным образом.

«Мы считаем, что глюкагон – важная дополнительная мера безопасности», - говорит Стивен Расселл (Steven Russell), эндокринолог из Массачусетской общей больницы (Massachusetts General Hospital) и один из руководителей проводимого исследования. Расселл объясняет, что гипогликемия может оказаться основной проблемой для больных диабетом – парадоксально, но чем лучше больной контролирует свой уровень сахара, тем большему риску он подвержен. Гипогликемия, возникающая при слишком выраженном падении уровня сахара, может сопровождаться такими признаками, как выделение холодного пота, озноб, головокружение и спутанность сознания, а в некоторых случаях может угрожать и жизни больного.

Новое исследование проводилось в первую очередь для проверки алгоритма, разработанного учеными для предварительного определения количеств инсулина и глюкагона, необходимых для поддержания нормального уровня сахара. Биоинженер из Бостонского университета (Boston University) и один из руководителей исследования Эдвард Дамиано (Edward Damiano) считает, что, так как инсулин медленно всасывается и медленно выводится из организма, алгоритм не может просто отвечать на текущий уровень сахара, а должен «предвидеть», в какую сторону он будет меняться. «При введении каждой дозы он отслеживает поднимающийся уровень инсулина, так же как и распад предыдущей дозы», - комментирует он работу прибора.

Система была опробована на 11 больных диабетом взрослых пациентах за течение 27 часов. За это время они трижды принимали пищу с высоким содержанием углеводов. Не полагаясь на показания подкожного монитора, исследователи использовали результаты прямых замеров сахара в крови, производимых каждые пять минут. Затем компьютерная программа рассчитала необходимые количества инсулина и глюкагона. Дозы вводились медицинскими сестрами.

В первом эксперименте система поддерживала нормальный уровень сахара у шести пациентов, но пять оставшихся испытывали гипогликемию, которую пришлось устранять приемом фруктового сока. Исследователи пришли к выводу, что этим пяти пациентам потребовалось больше, чем предполагалось, времени на усвоение и выделение полученного ими инсулина. Тогда ученые скорректировали параметры системы так, чтобы они соответствовали более медленной скорости усвоения инсулина, и повторили эксперимент. Теперь система смогла держать под контролем уровень сахара у всех участников испытания, хотя он был несколько выше у тех больных, которые в первом эксперименте усваивали инсулин немного быстрее.

Брюс Бакингем (Bruce Buckingham), детский эндокринолог из Стэнфордского университета (Stanford University), не принимавший участия в этом исследовании, считает, что главным достижением в разработке данной системы является ее способность работать даже в случае приема пациентами большого количества пищи. «Проблема приема пищи – серьезное препятствие» при разработке любой искусственной поджелудочной железы, подчеркивает Бакингем. Недавно группа из Кэмбриджского университета (Cambridge University), Великобритания, протестировала созданную ими аналогичную систему, но действующую только в ночное время, когда больные не принимают пищи. Бакингем считает, что другой проблемой при создании таких устройств будут периоды физических нагрузок, которые также вызывают колебания уровня сахара в крови.

Группа ученых, создавшая новое устройство, планирует дальнейшие испытания с использованием одобренного FDA монитора для непрерывного контроля глюкозы и системы для введения двух гормонов. Результаты экспериментов с системой с двумя гормонами будут сравниваться с результатами устройства, отслеживающего и вводящего только инсулин. Испытания будут проводиться в течение двух дней, при этом в них будут включены физические упражнения.

Аарон Ковальски (Aaron Kowalski), директор Проекта «Искусственная поджелудочная железа» (Artificial Pancreas Project) Научно-исследовательского фонда по изучению детского диабета (Juvenile Diabetes Research Foundation), частично финансирующий исследование, считает, что инсулин-глюкагоновая система представляет собой будущее технологий, применяемых для создания искусственной поджелудочной железы. «Наша конечная цель состоит в том, чтобы как это только возможно приблизиться к физиологии человека, не страдающего диабетом», - говорит он. Но вывести такую систему на рынок будет сложной задачей. Проблема заключается в том, что на рынке не существует одобренных FDA помп для введения двух различных веществ, и глюкагон в настоящее время используется только в экстренных случаях, когда у больных диабетом развивается опасная для жизни гипогликемия.

В более краткосрочной перспективе искусственная поджелудочная железа, отслеживающая уровень глюкозы и корректирующая его только с помощью инсулина, станет доступна гораздо раньше. Инсулиновая помпа, автоматически отключающаяся, если уровень глюкозы в крови становится слишком низким, уже одобрена в Европе. А Проект «Искусственная поджелудочная железа» работает с производящей мониторы глюкозы корпорацией Animas Corporation над системой, которая контролирует уровень сахара, но автоматически вводит инсулин, только если его уровень выходит за пределы определенного диапазона. Ковальски считает, что такой прибор, хотя и не полностью автоматизировавший доставку инсулина, все же может внушить больным относительное душевное спокойствие.

Оригинал статьи

Artificial Pancreas Tracks Two Hormones

Новый метод флуоресцентной маркировки белков

Химики из Массачусетского технологического института (Massachusetts Institute of Technology – MIT) разработали новый метод флуоресцентной маркировки белков, способный пролить свет на ранее неизвестные их функции.

В 90-х годах прошлого века зеленый флуоресцентный белок, известный как GFP, революционизировал клеточную биологию. Впервые обнаруженный и выделенный из тихоокеанской медузы Aequorea victoria в 1962 году белок GFP позволяет ученым визуализировать внутриклеточные белки и отслеживать выполнение ими своих функций. Два года назад биологам, открывших этот белок и разработавшим метод его применения как инструмента для лабораторных исследований, была присуждена Нобелевская премия.

Однако использование GFP как флуоресцентного датчика имеет один большой недостаток – белок такой громоздкий, что вмешивается в функционирование помеченных им белков, не позволяя им выполнять их обычные функции или достигать пункта назначения в процессе внутриклеточной транспортировки.

«Ученые давно пытаются найти лучшие способы маркировки белков», - говорит Кэтрин Вайт (Katharine White), аспирант лаборатории Элис Тинг (Alice Ting), доцента химии в MIT.

Тинг, Вайт и их коллеги придумали новый способ преодоления присущих GFP недостатков, пометив белки маркером гораздо меньшего размера. Их маркеры позволяют белкам нормально выполнять их обычные функции, предоставляя ученым возможность наблюдать за деятельностью молекул, которую еще никто и никогда не видел.

Свой метод, названный ПРАЙМ (PRIME - PRobe Incorporation Mediated by Enzymes – инкорпорация маркера посредством ферментов), ученые описали в Proceedings of the National Academy of Sciences.

Флуоресцентный белок GFP позволяет ученым отследить белки, которые невозможно увидеть никаким другим способом, и понять, как они перемещаются в клетке, руководя процессом ее деления и метаболизмом. Чтобы добиться такой возможности, исследователи добавляют кодирующий GFP ген к гену белка, который собираются изучать. После введения такого инженерного гена в клетки, он начинает производить белки, светящиеся зеленым флуоресцирующим светом.

Однако белок такого большого размера, как GFP (238 аминокислот), может вступать в конфликт с другими белками, такими как актин – молекулой, определяющей структуру клеток, обеспечивающей их подвижность и способность к коммуникации с другими клетками и принимающей участие в клеточном делении.

«Флуоресцентные белки используются для изучения актина уже давно, но слияние с ними оказывает негативное влияние на функции и перемещение самого актина», - объясняет Тао Уттамапинант (Tao Uttamapinant), один из первых авторов статьи в PNAS.

Чтобы преодолеть недостатки GFP, Тинг и ее ученики использовали голубой флуоресцентный маркер значительно меньшего размера, чем GFP. В противоположность GFP новый маркер не связан с белком-мишенью в процессе его производства внутри клетки. С помощью нового фермента, специально разработанного исследователями, маркер прикрепляется к своей мишени позднее.

Чтобы все это работало, ученые должны добавить ген нового фермента, известного как флуорофор-лигаза (fluorophore ligase), в каждую клетку одновременно с добавлением гена интересующего их белка. Параллельно с этим к белку-мишени прикрепляется короткая метка (13 аминокислот), позволяющая ферменту узнавать нужный белок. Когда в клетку добавляется голубой флуоресцентный маркер (7-гидроксикумарин - 7-hydroxycoumarin), фермент присоединяет его к короткой метке белка-мишени.

При использовании этого метода такие белки как актин могут свободно перемещаться по всей клетке и проникать в ее ядро, даже если они помечены флуоресцентным датчиком.

Исследователи также продемонстрировали, что можно пометить белки только в определенных частях клетки, например, в ядре, клеточной мембране или цитозоле, добавив к ферменту специфические генетические последовательности. В таком случае фермент будет прикреплять флуоресцентную метку только к белкам с определенной локализацией.

«Способность связываться с белками в определенной части клетки является самой впечатляющей особенностью нового метода», - комментирует разработку Джун Инь (Jun Yin), доцент химии из Университета Иллинойса (University of Illinois), Чикаго, не принимавший участия в этом исследовании. «Если вы изучаете белок, то первое, что вы хотите узнать, – это где он локализуется и каков маршрут его движения».

Инь, также занимающийся проблемой маркировки белков, считает, что разработанный в MIT новый метод достаточно универсален и может быть успешно модифицирован для обнаружения и других изменений в клетке. «Его можно использовать не только с флуорофорами, но и с другими датчиками, реагирующими на внутриклеточное микроокружение, например, на изменение кислотности или концентрации ионов», что прольет дополнительный свет на клеточные функции, считает ученый.

В настоящее время ученые из MIT занимаются разработкой ферментов, способных работать с другими типами флуоресцентных маркеров. Тинг также подала заявку на патент и собирается коммерциализировать свою технологию, чтобы ее могли использовать другие лаборатории.

Статья в Proceedings of the National Academy of Sciences: Chayasith Uttamapinant, Katharine A. White, Hemanta Baruah, Samuel Thompson, Marta Fernádez-Suárez, Sujiet Puthenveetil, and Alice Y. Tin. A fluorophore ligase for site-specific protein labeling inside living cells

Флуоресцентные маркеры в различных частях клетки – мембране, ядре, цитозоле.

По материалам

Giving proteins a new glow

Источник: NANO NEWS NET

Значительный вклад в развитие протеомики

Различные процессы в нашем организме регулируются последовательными изменениями в белках. Поэтому выявление таких изменений важно для дальнейшего изучения человеческого организма. Ученые из Института биохимии Макса Планка (Max Planck Institute of Biochemistry) в Мартинсриде, Германия, внесли в него существенный вклад: используя новый метод, они смогли идентифицировать более 6000 сайтов гликозилирования белков в различных тканях и таким образом создали прочную основу для понимания всех жизненно важных процессов.

Исследование опубликовано в журнале Cell.

Многие биологические механизмы, в том числе иммунный ответ, апоптоз или патогенез заболеваний, основаны на последовательном преобразовании отдельных компонентов белков – аминокислот. Ученые называют этот процесс посттрансляционной модификацией белка. Хотя технологии в протеомике в последние годы развиваются достаточно быстро, до сих пор возможность выявления таких модифицированных белков оставалась ограниченной. Особенно неисследованной оставалась трансформация белков в результате гликозилирования – присоединения углеводов к отдельной аминокислоте в составе белковой молекулы. Но этот процесс как раз и является одним из самых важных механизмов трансформации белков, играющим решающую роль в формировании органов и организмов. Если во время модификации белка возникает ошибка или процесс становится неконтролируемым, возможно развитие таких заболеваний, как болезни Альцгеймера и Кройтцфельдта-Якоба.

Ученые Института биохимии Макса Планка из научно-исследовательского отдела Протеомики и передачи сигнала, возглавляемые Маттиасом Манном (Matthias Mann), смогли пролить свет на этот процесс: они разработали высокоэффективный основанный на масс-спектрометрии метод, позволяющий выявлять сайты N-гликозилирования в белках различных тканей. N-гликозилирование - особый тип гликозилирования, в процессе которого углевод присоединяется к определенному компоненту белка – аминокислоте аспарагину (сокращенно N).

Новый метод основан на технологии фильтрации, что дает возможность экстрагировать из биологических образцов даже малодоступные белки. Ученые объединили этот метод с применением спектрометров с высоким разрешением, в результате чего смогли картировать 6367 сайтов гликозилирования белков в 2352 белках в четырех тканях и плазме крови мышей. Они обнаружили 74% уже известных гликосайтов и открыли еще 5753 сайта в самых разных белках мышей. Более того, они нашли новые паттерны аминокислотных последовательностей, связанные с N-гликозилированием. Анализ локализации внутриклеточных гликосайтов показывает, что сайты всегда ориентированы по направлению к внеклеточному пространству или к люмену эндоплазматического ретикулума, аппарату Гольджи, лизосомам или пероксисомам. Ученые не обнаружили никаких свидетельств того, что N-гликозилирование протекает в ядре клетки, цитозоле или митохондриях.

Эти открытия представляют собой важный вклад в протеомику, так как помогают лучше понять процессы, протекающие в человеческом организме. Более того, они могут сыграть значительную роль в изучении болезней. Например, ученые смогли идентифицировать некоторые сайты, связанные с различными заболеваниями: они обнаружили неизвестные до сих пор сайты N-гликозилирования в белках, играющих важную роль в развитии болезни Альцгеймера. Так как N-гликозилирование задействовано во многих процессах, идущих при болезни Альцгеймера со значительными нарушениями, ученые подозревают, что этот тип модификации белков непосредственно вызывает заболевание или, по крайней мере, решающим образом влияет на его течение. Таким образом, ученые надеются, что результаты их работы внесут вклад в дальнейшее изучение таких заболеваний, как болезнь Альцгеймера.

Аннотация к статье: D. Zielinska, F. Gnad, J. Wisniewski, M. Mann. Precision Mapping of an In Vivo N-Glycoproteome Reveals Rigid Topological and Sequence Constraints

Оригинал статьи

Alles auf Zucker

Источник: NANO NEWS NET

Новый метод определения фермента Катепсина К

Группа ученых из Технологического института Джорджии (Georgia Institute of Technology – Georgia Tech) разработала новый метод, надежно определяющий и измеряющий количество фермента, причастного к развитию остеопороза, артрита, атеросклероза, метастазов рака и других патологических процессов.

Участвующий в развитии остеопороза, артрита, атеросклероза и метастазов рака фермент катепсин К (cathepsin K) в прошлом успешно ускользал от надежного обнаружения в лабораторных экспериментах. Теперь же группа ученых из Технологического института Джорджии разработала тест для его обнаружения, основанный на методе желатиновой зимографии.

«Этот анализ очень важен, так как ученые и фармацевтические компании нуждаются в надежном методе определения небольших количеств катепсина К и количественной оценке его активности для разработки ингибиторов фермента, способных бороться с болезнями с минимумом побочных эффектов», - говорит Ману Платт (Manu Platt), доцент кафедры биомедицинской инженерии в Georgia Tech и Университете Эмори (Emory University).

Основной протеолитический фермент остеокластов катепсин К необходим для поддержания нормального уровня кальция в организме, но он может проявлять себя и как деструктивное вещество, так как обладает свойством разрушать кости, расщепляя коллаген и эластин.

Платт описал протокол определения катепсина К в июньском номере журнала Analytical Biochemistry.

По его мнению, новый анализ имеет целый ряд преимуществ над существующими методиками. Основным является то, что в клетках и тканях достоверно определяется именно зрелый катепсин К, а не его незрелые формы или один из 10 вариантов фермента: B, H, L, S, C, O, F, V, X или W.

Другое преимущество заключается в том, что он более чувствителен и менее дорог, чем существующие сейчас методы, являющиеся при этом еще и менее надежными. Новый метод позволяет определять катепсин К в количестве нескольких фемтомолей и не требует применения антител, которые обычно дороги и видоспецифичны.

«В наших экспериментах с помощью зимографии мы определяли зрелый катепсин К в количестве 3.45 фемтомолей, что от 10 до 50 раз превышает чувствительность его определения обычным методом Вестерн блоттинг (Western blotting)», - замечает Платт.

Кроме того, зимография позволяет ученым измерять активность фермента, в то время как Western blotting оценивает только его присутствие.

Для обнаружения зрелого катепсина К методом желатиновой зимографии Платт и аспирант Georgia Tech Вэйвэй Ли (Weiwei Li) сначала разделили присутствующие в клетках ферменты в соответствии с их молекулярными весами. Это позволило им отделить зрелый катепсин К от его незрелой формы и других вариантов фермента.

Затем, чтобы проверить идентичность и присутствие зрелого Катепсина К, ученые активировали находящиеся в геле ферменты. Они создали идеальные для катепсина К кислые условия и добавили ингибиторы, заблокировавшие активность всех ферментов, кроме зрелого катепсина К.

Для подтверждения активности фермента, определенной в лабораторных экспериментах, Платт и аспирант Georgia Tech Зэкэри Бэрри (Zachary Barry) разработали кинетическую модель его активности. Методом решения системы дифференциальных уравнений они могли рассчитывать концентрации незрелого, зрелого и инактивированного катепсина К, присутствующих в образцах, в течение всего времени проведения эксперимента.

«Работать с ферментами гораздо сложнее, чем с простыми белками, так как ферменты должны быть функциональны. Это означает, что для сохранения активности фермент должен быть правильно собран», – объясняет Платт. «Модель предсказывает, что даже после незначительной денатурации и рефолдинга, требуемых самим анализом, активность катепсина К, определенная в помощью зимографии, отражает то, что происходит в природе, а не является артефактом экспериментальной процедуры».

«Катепсины задействованы в развитии многих различных заболеваний, и значение этого анализа в том, что он позволяет измерять ранее неопределяемую активность фермента в нормальных и больных клетках и тканях», - замечает Платт.

В настоящее время с помощью своего метода команда Платта изучает, различается ли активность катепсина К в клетках больных метастатическим и не метастатическим раком молочной и предстательной железы, а также его роль в сердечно-сосудистых заболеваниях, таких как инсульт, и серповидно клеточной анемии у детей. Они также исследуют значение катепсина К для развития воспалений, связанных с ВИЧ.

«Это исследование должно предоставить новую информацию по целому ряду существующих патофизиологических состояний, в которых активность катепсина К ранее было невозможно обнаружить», - добавляет Платт.

Оригинал статьи

New Technique Detects Enzyme Implicated in Cancer, Atherosclerosis

Вглубь живой материи

Найден ключевой регулятор дифференциации жировых клеток

Новое исследование научного сотрудника Института биомолекулярных и биомедицинских исследований Конвэя (Conway Institute of Biomolecular and Biomedical Research) Университетского колледжа Дублина (University College Dublin - UCD) профессора Йохана Эрикссона (Johan Ericsson) выявило ключевой регулятор дифференцировки жировых клеток, который может стать новой молекулярной мишенью для препаратов против ожирения.

Результаты исследования опубликованы в научном журнале Proceedings of the National Academy of Sciences (PNAS).

Жировая ткань играет важную роль в регулировании баланса инсулина, а, следовательно, и баланса производства и потребления энергии в организме. Белая жировая ткань является хранилищем избыточной энергии в форме жира. Чрезмерный размер адипоцитов (жировых клеток) и/или их количество являются признаком ожирения – основного фактора риска развития диабета II типа, сердечно-сосудистых заболеваний и гипертонии.

Профессор Эрикссон и его коллеги продемонстрировали, что белок Fbxw7 регулирует каскад событий, контролирующих развитие жировых клеток. Они пришли к выводу, что, если Fbxw7 находится в неактивном состоянии, развитие жировых клеток усиливается. Как было установлено, у мышей инактивации одного только этого белка достаточно для превращения клеток-предшественников, или незрелых жировых клеток, в зрелые. Ученые также выяснили, что белок Fbxw7 блокирует развитие жировых клеток, взаимодействуя с другими белками в регуляторном каскаде, направленном на их уничтожение.

Комментируя результаты своего исследования, профессор Эрикссон говорит: «Картина, полученная нами при выяснении роли Fbxw7 в энергетическом и жировом обмене, предполагает, что он является ключевым регулятором этого процесса. Если это так, он может оказывать влияние на две важные медицинские проблемы – диабет II типа и ожирение».

В будущем ученым хотелось бы определить, каков точный механизм регуляции дифференциации адипоцитов, и выявить факторы и сигналы, контролирующие количество этого белка в жировых клетках. Важно также определить, изменяются ли уровни Fbxw7 в процессе развития ожирения.

Только в Ирландии диабетом II типа страдают около 200000 человек, и, по оценкам, в ближайшие годы этот показатель возрастет на 37%. Лечение этого заболевания и его осложнений создает огромную нагрузку на бюджет органов национального здравоохранения.

Аннотация к статье: M. T. Bengoechea-Alonso, J. Ericsson. The ubiquitin ligase Fbxw7 controls adipocyte differentiation by targeting C/EBP  for degradation

Оригинал статьи

UCD research identifies key regulator of fat cell development

Ассоциированный со старением ген играет важную роль в дифференциации стволовых клеток

Ген, играющий определенную роль в процессе старения, вероятно, оказывает влияние и на регуляцию дифференциации эмбриональных столовых клеток. К такому выводу пришли ученые из Центра биологии стволовых клеток и регенеративной медицины (Center for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine) и медицинского факультета Университета Томаса Джефферсона (Thomas Jefferson University).

В исследовании, опубликованном в журнале Aging Cell, ученые изучали взаимодействие белков, контролирующее молчание Oct4 – ключевого транскрипционного фактора, имеющего решающее значение для сохранения эмбриональными стволовыми клетками свойства плюрипотентности.

Белок WRNp является продуктом гена, ассоциированного с синдромом Вернера, аутосомно-рецессивного расстройства, признаком которого является преждевременное старение, а сам синдром Вернера является общепринятой моделью старения.

Сначала исследователи обнаружили, что WRNp накапливается вблизи промоутера Oct4 в дифференцирующихся стволовых клетках. Затем они пришли к выводу, что WRNp взаимодействует с еще одним белком, называемым Dnmt3b, контролируя тем самым метилирование ДНК в промоутере Oct4, о чем свидетельствует работа, возглавляемая доктором медицины Рене Дэниелом (René Daniel).

Ранее белок Dnmt3b считался ключевым фактором в метилировании ДНК промоутера Oct4. Метилирование ДНК промоутера Oct4 инактивирует ген Oct4. Инактивация, или молчание, этого гена необходимо для дифференциации стволовых клеток.

«Мы показали, что уменьшение накопления WRNp блокирует поступление Dnmt3b к промоутеру Oct4 и в результате снижает метилирование», - говорит доктор Дэниел.

До сих пор основное внимание в исследовании роли WRNp в процессе старения было сосредоточено на теломерах. Эти исследования показали, что при синдроме Вернера теломеры претерпевают ускоренное укорачивание. Но еще не доказано, что именно это является главной ролью белка WRNp в процессе старения.

«Наши результаты свидетельствуют о новой функции WRNp и демонстрируют, что WRNp регулирует ключевой шаг в дифференциации плюрипотентных стволовых клеток», - говорит доктор Дэниел. «Полученные нами данные подтверждают гипотезу о том, что ослабление дифференциации стволовых клеток играет определенную роль в процессе старения. Отсутствие дифференцированных клеток может внести свой вклад в невозможность поддержания функций органов и тканей в поздние периоды жизни».

Аннотация к статье: Johanna A. Smith, Abibatou M. N. Ndoye, Kyla Geary, Michael P. Lisanti, Olga Igoucheva, René Daniel. A role for the Werner syndrome protein in epigenetic inactivation of the pluripotency factor Oct4

Оригинал статьи

Gene Related to Aging Plays Role in Stem Cell Differentiation

Новое о репликации РНК-содержащих вирусов

Нихал Алтан-Бонне (Nihal Altan-Bonnet), доцент клеточной биологии Университета Рутгерса (Rutgers University) в Ньюарке, и ее исследовательская группа сделали значительное открытие в области изучения репликации РНК-содержащих вирусов.

Определенные РНК-вирусы – полиовирусы, вирусы гепатита С и вирусы Коксаки – и, возможно, другие семейства вирусов копируют себя, захватывая фермент клетки-хозяина для создания «фабрик» по репликации, обогащенных специфическим липидом, объясняет Алтан-Бонне. В отсутствии этого липида – фосфотидилинозитол-4-фосфата (phosphatidylinositol-4-phosphate - Pl4P) – РНК-вирусы не могут синтезировать вирусную РНК и реплицироваться. Являясь ключевыми структурными компонентами клеточных мембран, липиды часто служат сигнальными молекулами и стыковочными сайтами для белков.

Вирусная репликация – это процесс, при котором вирусные частицы производят свои копии в клетке-хозяине. Такие копии затем продолжают инфицировать другие клетки. РНК-содержащий вирус – это вирус, который в качестве генетического материала несет не ДНК, а РНК. Многие возбудители вирусных заболеваний человека являются РНК-вирусами, включая атипичную пневмонию, СПИД, лихорадку Западного Нила и те, изучением которых занимается Алтан-Бонне.

Как сообщается в журнале Cell, Алтан-Бонне и ее коллеги впервые установили, что некоторые РНК-содержащие вирусы контролируют клеточный фермент, создавая репликационный компартмент на мембране клетки, наполненный липидом PI4P. В свою очередь эти липиды позволяют РНК-вирусам привлекать и активировать ферменты, необходимые для репликации. В неинфицированных клетках уровни липида PI4P низки, в то время как в инфицированных вирусом они резко возрастают. Открытие ученых не только открывают несколько возможностей для предотвращения распространения различных вирусных инфекций, но и помогает пролить свет на регуляцию синтеза РНК на клеточном уровне и, потенциально, на развитие некоторых форм рака.

«Цель вируса – воспроизвести самого себя», - замечает Алтан-Бонне. «Чтобы механизмы его репликации работали, вирусу нужно создать идеальное липидное окружение, что он и делает, захватывая ключевой фермент клетки-хозяина».

Исследователи смогли идентифицировать вирусный белок (так называемый белок А3 в полиовирусах и коксакивирусах), захватывающий и использующий клеточный фермент (фосфатидилинозитол-4-киназа III бэта - phosphatidylinositol-4-kinase III beta). Кроме того, они смогли помешать процессу репликации введением препарата, блокирующего активность клеточного фермента, если он захвачен вирусом. Лекарственная терапия, предотвращающая вирусную репликацию, потенциально может быть направлена и на предотвращение самого захвата фермента.

Во многих случаях процесс захвата этого фермента вирусами заканчивается медленным умиранием клетки, приводящим к таким проблемам как сердечные и сосудистые осложнения при инфицировании вирусами Коксаки и неврологические нарушения при полиовирусах.

Используя полученные за последнее время результаты, Алтан-Бонне планирует исследовать зависимость от PI4P других вирусов, а также роль, которую могут играть другие липиды для различных семейств вирусов. Например, вирус атипичной пневмонии для своей репликации также требует липидного окружения, поэтому ее лаборатория сейчас работает вместе с исследующими этот вирус учеными с целью установления, какой именно липид необходим для его репликации. Кроме того, они собираются изучить роль липидов в регуляции синтеза РНК в клетках, что потенциально может способствовать становлению новых взглядов на клеточные мутации, имеющие место при раке.

«Принимая во внимание, что большинство из того, что мы знаем о клеточных процессах, исторически происходит из изучения вирусов, наша работа может пролить новый свет на роль, которую играют липиды в регуляции экспрессии генетического материала клеток», - отмечает Алтан-Бонне.

Исследования Алтан-Боннет в области репликации РНК-содержащих вирусов поддерживаются грантом Национального научного фонда (National Science Foundation) и фондом Буша (Busch Foundation).

Аннотация к статье: Nai-Yun Hsu, Olha Ilnytska, Georgiy Belov, Marianita Santiana, Ying-Han Chen, Peter M. Takvorian, Cyrilla Pau, Hilde van der Schaar, Neerja Kaushik-Basu, Tamas Balla. Viral Reorganization of the Secretory Pathway Generates Distinct Organelles for RNA Replication

Оригинал статьи

How RNA Viruses Copy Themselves: Hijack Cellular Enzyme to Create Viral Replication Factories on Cell Membranes

Полная или частичная перепечатка любого материала разрешается и приветствуется при обязательной гиперссылке на рассылку «Нанотехнологии в медицине и биологии». Часть моих переводов принадлежат NANO NEWS NET и при их перепечатке просьба ссылаться на этот ресурс.