ВЫПУСК 104

Леденцы на палочке и подледный лов: молекулярные шаблоны для нанопор

Используя две экзотические технологии, включая молекулярную версию «подледного лова», группа ученых из Национального института стандартов и технологии (National Institute of Standards and Technology - NIST) разработала методы точного измерения длины нанопоры, мельчайшего канала в клеточной мембране. Описанная ими в недавно опубликованной статье «молекулярная линейка» может служить методом калибровки отдельной нанопоры, чей диаметр в среднем в 10000 раз меньше, чем толщина человеческого волоса. Эта информация может оказаться полезной для большого количества различных приложений, например, для быстрого анализа ДНК.

Исследования в NIST и других научно-исследовательских центрах показали, что отдельная нанометровая пора в тонкой мембране может быть использована как миниатюрная аналитическая лаборатория для обнаружения и описания биологических молекул, таких как ДНК или токсины, когда они проходят через такую пору или блокируют ее. Созданная учеными система теоретически вполне может поместиться в одном устройстве-микрочипе и использоваться для широкого круга приложений. Однако чтобы такая мини лаборатория начала работать на практике, необходимо точное определение размеров и структурных особенностей нанопоры.

В ходе последних экспериментов исследователи из NIST и Университета Мэриленда (University of Maryland – UM) сначала создали мембрану – двухслойную структуру из молекул липидов – подобную той, которая обнаружена в животных клетках. С помощью специально созданного для проникновения через клеточные мембраны белка (альфа-гемолизина, продуцируемого Staphylococcus aureus) они «просверлили» в своей искусственной мембране наноразмерную пору. Когда на мембрану подается напряжение, заряженные молекулы, такие как одноцепочечные ДНК, устремляются в пору, а поток ионов ослабевает на время, пропорциональное размеру цепочки, что позволяет легко рассчитать ее длину.

Если цепочка достаточно длинна, чтобы достичь самой узкой части нанопоры – известной как пинч-точка – сила электрического поля за ней протолкнет молекулу через оставшуюся часть канала. Используя эту особенность, ученые из NIST и UM разработали метод ДНК-зондирования для измерения расстояния от начала поры с каждой стороны мембраны до пинч-точки и определения общей длины нанопоры путем простого сложения результатов двух предшествующих измерений. Зонды состоят из цепочек ДНК известной длины с полимерной сферой на одном из концов. Сфера не дает зонду целиком пройти через нанопору, оставляя конец протянувшейся вдоль канала цепочки ДНК свободно свисающим из нее. Если цепочка достигает пинч-точки, сила, которая обычно заставляет свободную цепочку ДНК проходить узкий проход, задерживает зонд на месте (так как полимерная сфера блокирует его с другой стороны), что и позволяет определить расстояние до пинч-точки. Если цепочка короче, чем расстояние до пинч-точки, она выскакивает из нанопоры, сообщая ученым, что для измерения расстояния до сужения нужна цепочка большей длины.

Исследователи из NIST и UM разработали и второе средство измерения длины нанопоры для подтверждения результатов, полученных методом «леденца на палочке». В этой системе полимерные молекулы свободно циркулируют в растворе, находящемся с внутренней стороны мембраны. ДНК-датчики различной длины с «надетыми» на них полимерными сферами вынуждены по одному проходить через нанопору с противоположной стороны. Если конец цепочки зонда имеет достаточную длину, чтобы пройти весь канал, он свяжется со свободной молекулой полимера в растворе. Это и определит длину канала.

Кроме того, такой метод «подледного лова» дает представление о структуре нанопоры. Когда цепочка ДНК прокладывает себе путь через канал, изменения электрического напряжения сопровождаются изменениями формы канала и соответствуют им. Эта информация может быть успешно использована для создания карты прохода.

Аннотация к статье: S.E. Henrickson, E.A. DiMarzio, Q. Wang, V.M. Stanford and J.J. Kasianowicz. Probing single nanometer-scale pores with polymeric molecular rulers. The Journal of Chemical Physics 132, 135101

Графическое изображение того, как метод «подледного лова» позволяет определить длину нанопоры. Оба изображения показывают цепочки ДНК известной длины с полимерными сферами на конце (оранжевый шарик). Если длина цепочки достаточна для полного прохождения канала (слева), она «поймает на крючок» циркулирующий в растворе полимер (зеленый шарик) с другой стороны мембраны и определит длину нанопоры. Если ее длина недостаточна, ДНК-зонд выскачет из поры (справа). Credit: J.Robertson, NIST

По материалам

Lollipops and Ice Fishing: Molecular Rulers Used to Probe Nanopores

Источник: NANO NEWS NET

Куркуминовые наночастицы увеличивают чувствительность раковых клеток к терапии

Предварительная обработка куркумином, компонентом, входящим в состав специи куркумы, делает клетки рака яичников более уязвимыми для химио- и лучевой терапии. Ученые, сообщившие об этом в открытом журнале Journal of Ovarian Research, обнаружили, что доставка куркумина с помощью очень маленьких (меньше 100 нм) наночастиц усиливает эффект сенсибилизации.

Группой исследователей из Сэнфордского научно-исследовательского центра (Sanford Research) и Университета Южной Дакоты (University of South Dakota), проводившей это исследование in vitro, руководили доктора философии Сабхаш Чаухан (Subhash Chauhan) и Меена Джэгги (Meena Jaggi).

«Наша стратегия увеличения эффективности и уменьшения токсичности терапии рака заключается в том, чтобы усилить чувствительность раковых клеток к химио- и лучевой терапии, используя для этого натуральные пищевые растительные вещества, такие как куркумин. Однако куркумин плохо усваивается организмом, что снижает его эффективность. Мы разработали наночастицу, Nano-CUR, для увеличения его биодоступности, а также для адресной доставки куркумина в опухоли», - говорят ученые.

Исследователи протестировали действие своих куркуминовых наночастиц на резистентных к терапии клетках рака яичников. Им впервые удалось показать, что предварительная обработка снижает дозу цисплатина и облучения, необходимую для подавления роста раковых клеток. По мнению Чаухана, «доставка куркумина с помощью наночастиц будет способствовать дальнейшей сенсибилизации и расширит возможности терапии. Это исследование демонстрирует новую стратегию предварительного воздействия, которая может быть реализована в доклинических испытаниях на животных и в будущих клинических испытаниях».

Cтатья в Journal of Ovarian Research: Curcumin induces chemo/radio-sensitization in ovarian cancer cells and curcumin nanoparticles inhibit ovarian cancer cell growth, Murali M Yallapu, Diane M Maher, Vasudha Sundram, Maria C Bell, Meena Jaggi and Subhash C Chauhan.

Оригинал статьи

Curcumin nanoparticles 'open up' resistant cancers

Американские ученые уточнили условия образования липосом

Несколько лет назад исследователи из Национального института стандартов и технологии (National Institute of Standards and Technology - NIST) первыми разработали метод использования микрофлюидного устройства для создания наполненных жидкостью пузырьков из фосфолипидов – жировых комплексов, являющихся строительными блоками клеточных мембран. Такие структуры ценны своим потенциальным использованием в качестве агентов для доставки лекарственных препаратов непосредственно в раковые или другие больные клетки организма.

Широкое применение липосом в качестве искусственных носителей лекарственных препаратов ограничено целым рядом факторов, таких как непостоянство размера, структурная нестабильность и высокая стоимость производства. В новом исследовании ученые из NIST и Университета Мэриленда (University of Maryland - UM) уточнили процесс производства липосом с помощью разработанной ими технологии – известной как COMMAND (Controled Microfluidic Mixing And Nanoparticle Determination) – для достижения максимальной эффективности. Их целью было лучше понять, как работает COMMAND, производящий липосомы с контролируемым диаметром от 50 до 150 нанометров, сохраняющие постоянный размер и дешевые в производстве, с помoщью устройства, которое можно назвать «конвейерной линией на микрочипе».

Ученые изготавливают микрофлюидное устройство COMMAND путем протравливания мельчайших каналов в кремниевой пластине, используя методы, применяемые в производстве интегральных схем. В COMMAND молекулы фосфолипидов, растворенные в изопропиловом спирте, поступают через центральный входной канал в смесительный канал и фокусируются в струю жидкости водным раствором (который при производстве будет нести лекарство или другой груз для пузырьков), поступающим по двум боковым каналам. Компоненты смешиваются благодаря диффузии вдоль поверхностей текущих потоков жидкостей, приводя к самосборке молекул фосфолипидов в наноразмерные пузырьки контролируемого размера. Чтобы выяснить влияние различных конструкций микрофлюидных устройств и состояний потоков жидкостей на образование липосом, были проведены специальные исследования.

Ученые установили, что процесс образования липосом существенно зависит от течения и смешивания жидкостных потоков. Размер липосом может быть «настроен» воздействием на скорость потоков, что в сочетании с размерами микрофлюидного устройства в конечном итоге определяет условия, при которых происходит смешивание жидкостей. Сильно сфокусированный поток несущего фосфолипиды спирта, текущий с небольшой скоростью, стремится быстро смешаться с буферным раствором в начале смесительного канала и образует маленькие везикулы. Менее сфокусированный поток, имеющий высокую скорость, проходит дальше по длине канала, увеличивая, таким образом, время смешивания и приводя к образованию более крупных пузырьков.

В регулировании скорости образования, а также количества и концентрации липосом определенную роль играет и геометрия каналов.

Полученная исследователями информация может оказаться важной для будущего клинического применения липосом, а также для интеграции системы COMMAND в более сложные основанные на микрочипах системы для нужд здравоохранения.

Компьютерное моделирование показывает смешивание воды и изопропилового спирта в микрофлюидном устройстве COMMAND. Спирт, который при эксплуатации будет содержать растворенные фосфолипиды, течет слева направо, поступая через центральный вход, и фокусируется водой, подаваемой через верхний и нижний каналы. Регулировка скорости потока дает сильно сфокусированный (вверху) и более широкий (внизу) потоки, позволяя контролировать размер липосом. Фото: NIST

Анонсы к статьям:

Jahn et al. Controlled Vesicle Self-Assembly in Microfluidic Channels with Hydrodynamic Focusing. Journal of the American Chemical Society, 2004; 126 (9): 2674 DOI:

Jahn et al. Microfluidic Mixing and the Formation of Nanoscale Lipid Vesicles. ACS Nano, 2010; 4 (4): 2077 DOI:

Оригинал статьи

Deliver Drugs Within the Body With Precision With the Help of Liposomes?

Источник: NANO NEWS NET

Наночастицы исследуют процесс активации Т-клеток

Группа ученых под общим руководством Университета Алберты (University of Alberta) сделала большой шаг к пониманию того, как Т-клетки активируются в процессе иммунного ответа, использовав для изучения этого вопроса нанотехнологии и клеточную биологию. Т-клетки являются важнейшим триггером, запускающим ответ организма на инфекцию.

Кристофер Каиро (Christopher Cairo) и его коллеги изучают, как активируется важнейший триггер клеточного иммунного ответа – Т-клетки. Он исследует молекулу, известную как CD45, и ее роль в активации Т-клеток. Активация CD45 является частью цепочки событий, позволяющих организму вырабатывать Т-клетки в случае инфицирования и, что не менее важно, подавлять гиперактивные Т-клетки, которые могут нанести вред организму.

Каиро и его команда используют нанотехнологии для изучения взаимодействия отдельных молекул в живых клетках. Метод позволяет им увидеть движение этих молекул в наномасштабе, так что они могут «увидеть» молекулярные взаимодействия. Чтобы видеть движение белков, исследователи пометили молекулы наночастицами, а затем наблюдали полученные комплексы под микроскопом. Это первый случай исследования CD45 подобным способом, но самым большим достижением ученых является наблюдение за взаимодействием CD45 с другими внутриклеточными молекулами, необходимыми для выполнения ее функций.

Ученые обнаружили, что CD45 связана с цитоскелетом клетки – сетчатой структурой белков, определяющих форму и структуру клеток. Они также наблюдали, как отдельные белки удерживают СВ45 на цитоскелете.

«Одно дело наблюдать, как молекулы взаимодействуют в пробирке», - говорит Каиро. «И совсем другое, видеть, как этот процесс происходит в живой клетке». Он считает, что лучшее понимание регулятора иммунного ответа CD45 в конечном итоге приведет ученых к его использованию как средства контроля над функциями Т-клеток.

«Если бы мы знали, когда активируется CD45 или как каждая молекула-партнер помогает ее работе, мы могли бы использовать это преимущество и создать ингибитор», - говорит Каиро. «Конечно, это нелегкая задача, и на настоящий момент мы пытаемся понять молекулярный механизм этого процесса».

Помимо группы Каиро из Университета Алберты свой вклад в работу внесли группы математика Дэна Кумбса (Dan Coombs) из Университета Британской Колумбии (University of British Columbia), биохимика Джона Морроу (Jon Morrow) из Медицинской школы Йельского университета (Yale University Medical School) и биофизика Дэвида Голана (David Golan) из Гарвардской медицинской школы (Harvard Medical School).

Работа Каиро и его соавторов опубликована в журнале The Journal of Biological Chemistry.

Аннотация к статье: C. W. Cairo, R. Das, A. Albohy, Q. J. Baca, D. Pradhan, J. S. Morrow, D. Coombs, D. E. Golan. Dynamic Regulation of CD45 Lateral Mobility by the Spectrin-Ankyrin Cytoskeleton of T Cells.

Оригинал статьи

U Alberta-led team studies T cell activation with nanoparticles

Магнитно-флуоресцентные наночастицы делают видимыми опухоли головного мозга

Ученые Государственного университета Огайо (Ohio State University) разработали метод улучшения качества МРТ-сканов и физической видимости опухолей головного мозга, что позволит нейрохирургам более точно определять локализацию злокачественных новообразований и добиваться более полного их удаления.

Ученые Государственного университета Огайо проводят эксперименты с различными наночастицами, которые однажды можно будет вводить в кровь пациента, чтобы помочь хирургам удалить смертельную опухоль головного мозга – глиобластому.

Они создали маленькую частицу, называемую нанокомпозитом, магнитную и флуоресцентную одновременно. Размер такого нанокомпозита менее 20 нанометров (нанометр – миллиардная часть метра). Лист бумаги, например, имеет толщину 100000 нанометров. О своей разработке ученые сообщают в журнале Nanotechnology.

«Наша стратегия заключалась в том, чтобы соединить две частицы с различными свойствами в одну с несколькими свойствами одновременно», - объясняет Джессика Винтер (Jessica Winter), доцент кафедры химической и биомолекулярной инженерии и кафедры биомедицинской инженерии Государственного университета Огайо.

Магнитные наночастицы усиливают цветовые контрасты МРТ, позволяя врачам увидеть существующие или предполагаемые опухоли до операции. Флуоресцентные наночастицы могут изменить цвет, которым при специальном освещении опухоль светится непосредственно в мозге.

«Применение такой многофункциональной частицы даст нейрохирургам большие преимущества, так как позволит им не только лучше изучить опухоль с помощью МРТ до хирургического вмешательства, но и физически видеть ее во время операции», - говорит Винтер. «Мы пытаемся разработать единый нанокомпозит с магнитными – можно изучать опухоль с помощью магнитно-резонансной томографии до операции – и с флуоресцентными свойствами – нейрохирурги во время операции могут просто направить на нее свет, и она будет светиться определенным, например, зеленым, цветом. Тогда они могут просто удалить все зеленое».

«Традиционные магнитные контрастирующие агенты позволяют изучать опухоль с помощью магнитно-резонансной томографии, но вы ничего не увидите во время операции», - добавляет Винтер.

Исследование Винтер представляет убедительное доказательство того, что можно разработать наночастицу с двумя свойствами. Однако такие многофункциональные частицы невозможно использовать в доклинических и клинических испытаниях, так как флуоресценция достигается за счет теллурида кадмия – токсичного вещества.

«Сейчас мы работаем над альтернативой флуоресцентной частицей, состоящей из углерода. Это позволит устранить сложности, возникающие при введении в организм частиц из теллурида кадмия», - объясняет ученый.

Работа Винтер может принести огромную пользу больным со смертельной опухолью мозга – глиобластомой. Глиобластома обычно находится в височной или лобной доле головного мозга, а опухоли с такой локализацией особенно трудно диагностировать и удалять.

Сочетание свойств двух частиц предоставит врачам помощь как до, так и во время операции, убеждена Винтер.

Одним из успехов в создании новой нанокомпозитной частицы является и разработка самого метода ее получения. Достичь сочетания частиц с такими свойствами в результате процесса, известного как допирование, обычно очень трудно. Винтер и ее коллеги использовали подход, который еще никем не был применен. Они решили связать флуоресцентную и магнитную частицы при очень высокой температуре.

«Ключевым является то, что наш синтез идет при очень высокой температуре – около 350 градусов Цельсия», - объясняет Винтер. «Синтез был непредсказуем, но успешен, и мы были очень рады, когда увидели, что получили».

Главный нейрохирург, сотрудничающий с Винтер и ее коллегами, доцент кафедры нейрохирургии, Атом Саркар (Atom Sarkar), надеется в ближайшем будущем опробовать этот подход на животных. Но сначала ученым нужно создать частицу, не содержащую токсичных компонентов. Если результаты останутся столь же обнадеживающими, подобные многофункциональные наночастицы станут серьезной инновацией в нейрохирургии в течение следующих пяти лет.

Аннотация к статье: Shuang Deng, Gang Ruan, Ning Han, Jessica O Winter. “Interactions in fluorescent-magnetic heterodimer nanocomposites”

Оригинал статьи:

Tiny particles may help surgeons by marking brain tumors

Источник: NANO NEWS NET

В лабораториях ученых

Флуоресцентные маркеры предраковых состояний

Серия новых визуализирующих агентов может подсвечивать опухоли с начала их образования – до того, как они станут смертельными – и сигнализировать об их переходе в агрессивные раковые формы.

Соединения – флуоресцентные ингибиторы фермента циклооксигеназы-2 (ЦОГ-2) (cyclooxygenase-2 – COX-2) – могут широко применяться для ранней диагностики опухолей и их перехода из предракового состояния к более агрессивному росту, определяя границы новообразования во время хирургической операции.

«Мы очень рады, что приближаемся к клиническим испытаниям наших новых агентов», - говорит доктор философии Лоренс Марнетт (Lawrence Marnett), руководитель группы ученых из Университета Вандербильта (Vanderbilt University), разработавшей соединения, описанные в статье в журнале Cancer Research.

ЦОГ-2 – привлекательная мишень для молекулярной визуализации. Фермент не обнаруживается в большинстве здоровых тканей и «включается» только в очагах воспаления и опухолях, объясняет Марнетт. ЦОГ-2 начинает экспрессироваться на ранних стадиях малигнизации – в предраковом состоянии - но не обнаруживается в нормальных тканях. И по мере того, как опухоль растет и становится все более злокачественной, уровни ЦОГ-2 поднимаются.

Соединения, избирательно связывающиеся с ЦОГ-2 и несущие флуоресцентные маркеры, функционируют как «маяки», указывающие на опухолевые клетки и воспалительные процессы.

Марнетт и его коллеги ранее уже показали, что флуоресцентные ингибиторы ЦОГ-2, названными ими флуорококсибами ("fluorocoxibs"), являются полезными датчиками связывания белка, но их ранние молекулы не подходили для клеточной визуализации in vivo.

«Наша задача состояла в том, чтобы получить ЦОГ-2-селективные соединения (не связывающиеся с родственным ферментом ЦОГ-1), имеющие желаемые свойства флуоресценции и попадающие в ткани в естественных условиях», - объясняет Марнетт.

Для разработки таких соединений Джейшим Уддин (Jashim Uddin), доктор философии, научный сотрудник кафедры биохимии, взял за основу «ключевую» химическую структуру, составляющую «ядро» противовоспалительных препаратов индометамица и целекоксиба. С этой структурой он связал различные флуоресцентные молекулы, синтезировав в конечном итоге более 200 соединений. Ученые протестировали каждое из этих соединений на взаимодействие с очищенными белками ЦОГ-2 и ЦОГ-1 и выявили те из них, которые проявляли перспективную ЦОГ-2-избирательность и хорошую флуоресценцию в культуре клеток и на животных. Отбор прошли 2 соединения.

В экспериментах, проведенных старшим научным сотрудником Брендой Круз (Brenda Crews), исследователи оценили возможности этих соединений in vivo на трех различных животных моделях: вызванном раздражением воспалении подушечек лап мышей, перевитых мышам человеческих опухолях и спонтанных опухолях мышей.

В каждом случае оба флуорококсиба - введенные внутривенно и в брюшную полость – накапливались в воспаленной или опухолевой ткани, придавая ей флуоресцентное свечение.

До перехода к клиническим испытаниям ученые проведут дополнительные токсикологическое и фармакологическое тестирование и разработают конкретные параметры применения соединений для флуоресцентной визуализации кожи или тканей доступных для эндоскопии (пищевод или толстая кишка).

Например, в пищеводе предраковое состояние, называемое пищеводом Барретта, может перейти сначала в дисплазию низкой, а затем и высокой степени и в конечном итоге в рак с выживаемостью в 1 год только 10 процентов больных. Для больного с пищеводом Барретта диагностика перехода к дисплазии жизненно важна. Проблема состоит в том, что дисплазия ничем видимо не отличается от предракового поражения слизистой Барретта, поэтому врачи берут образцы ткани для биопсии случайным образом и могут пропустить зоны дисплазии.

«С помощью эндоскопа врач сможет увидеть скопление клеток, светящихся благодаря нашим флуорококсибам, и точно определить место для биопсии», - говорит Марнетт. «Так как уровни ЦОГ-2 растут при раковой прогрессии практических всех солидных опухолей, мы считаем, что такие средства визуализации будут иметь очень широкую сферу применения».

Исследователи изучают возможность применения своих соединений и для адресной доставки химиотерапевтических препаратов непосредственно к ЦОГ-2-экспрессирующим клеткам, присоединив противораковые средства к ядру ингибитора ЦОГ-2 вместо флуоресцентного маркера.

У мышей, несущих мутацию, вызывающую семейный, или диффузный, аденоматозный полипоз (min-мыши), развиваются небольшие опухоли тонкого кишечника, экспрессирующие ЦОГ-2. Инъекция флуорококсиба делает кишечный полип видимым. Фото: Lawrence Marnett, Ph.D., and colleagues

Аннотация в статье: M. J. Uddin, B. C. Crews, A. L. Blobaum, P. J. Kingsley, D. L. Gorden, J. O. McIntyre, L. M. Matrisian, K. Subbaramaiah, A. J. Dannenberg, D. W. Piston, L. J. Marnett. Selective Visualization of Cyclooxygenase-2 in Inflammation and Cancer by Targeted Fluorescent Imaging Agents.

Оригинал статьи:

Fluorescent Compounds Make Tumors Glow

Полная или частичная перепечатка любого материала разрешается и приветствуется при обязательной гиперссылке на рассылку «Нанотехнологии в медицине и биологии». Часть моих переводов принадлежат NANO NEWS NET и при их перепечатке просьба ссылаться на этот ресурс.