ВЫПУСК 91

Начаты клинические испытания наночастиц с siRNA в качестве нового противоракового средства

Группа ученых и клиницистов из Калифорнийского технологического института (California Institute of Technology) опубликовала первое доказательство того, что адресные наночастицы, используемые как экспериментальное терапевтическое средство и вводимые непосредственно к кровь больного, могут достигать опухоли, доставлять туда двухцепочечные малые интерферирующие РНК (siRNA) и «выключать» важный ген рака, используя механизм, известный как РНК- интерференция (RNAi).

Более того, ученые впервые продемонстрировали, что созданный ими новый тип терапии может рассматриваться как дозозависимый, то есть, чем большее количество наночастиц вводится в кровь, тем больше их достигает опухолевых клеток.

Результаты, опубликованные в он-лайн издании журнала Nature, свидетельствуют о возможности одновременного использования наночастиц и основанной на РНК- интерференции терапии для лечения больных и открывают дорогу будущим методам терапии рака и других болезней на генетическом уровне, говорит Марк Дэвис (Mark Davis), профессор химической инженерии Калифорнийского технологического института и руководитель исследования.

Открытие РНК-интерференции, механизма, с помощью которого двухцепочечные РНК подавляют гены, принесло Эндрю Файеру (Andrew Fire) и Крейгу Мелло (Craig Mello) Нобелевскую премию в области физиологии и медицины за 2006 год. Их первая публикация о новом механизме, найденном у червей, появилась в Nature в 1998 году. С тех пор потенциальные возможности этого типа подавления генов как нового метода лечения таких заболеваний как рак оцениваются как очень высокие.

«РНК-интерференция – новый способ остановки синтеза белков», - говорит Дэвис. Так как ее мишенью является не белок, РНК-интерференция является особенно мощным инструментом. Уязвимые места белков могут быть спрятаны внутри их трехмерной структуры, и многие терапевтические средства не могут достичь таких участков. В противоположность этому РНК-интерференция имеет своей целью матричные РНК (mRNA), кодирующие информацию, в первую очередь необходимую для сборки белка.

«В принципе это означает, что каждый белок теперь может рассматриваться как мишень для воздействия лекарственных препаратов, так как его подавление осуществляется путем разрушения mRNA».

Однако на пути использования РНК-интерференции как метода лечения людей существовало несколько препятствий. Одним из наиболее сложных был вопрос о том, как доставить терапевтическое средство, представляющее собой хрупкие молекулы siRNA, в клетки опухоли после их введения в кровь. У Дэвиса, однако, было решение этой проблемы. Еще до открытия феномена РНК-интерференции он и его коллеги начали разработку способов доставки в клетки нуклеиновых кислот. В итоге они создали четырехкомпонентную систему – уникальный полимер, способный к самосборке в адресную наночастицу, содержащую siRNA.

«Такие наночастицы способны перенести молекулы siRNA в определенные органы», - говорит Дэвис. Как только наночастицы достигают своей цели – в данном случае, клеток раковых опухолей – они высвобождают siRNA.

Научные результаты, описанные в статье в Nature, это результаты первого этапа клинических испытаний таких наночастиц, начатых в мае 2008 года. Первый этап клинических испытаний – это испытание на безопасность. На этой стадии определяется, не является ли данный препарат или другой метод терапии вредным или токсичным.

Используя новую методику, ученые смогли обнаружить и получить изображение наночастиц внутри клеток в биопсийных образцах опухолей нескольких участников испытаний. В дополнении к этому Дэвис и его коллеги сумели доказать, что чем выше введенная в организм больных доза наночастиц, тем большее количество наночастиц обнаруживается в клетках опухоли – первый пример зависящей от дозы реакции организма на введение адресных наночастиц.

Более того, данные свидетельствуют о том, что молекулы siRNA с успехом сделали свое дело. При анализе опухолевых клеток ученые обнаружили, что уровень mRNA, кодирующих белок клеточного роста рибонуклеотидную редуктазу, снизился. Это снижение, в свою очередь, привело к потере белка.

Ученые показали, что найденные фрагменты mRNA имели именно такую длину и последовательность нуклеотидов, какую они должны были иметь, если бы разрыв их цепочек произошел в месте, предусмотренном взаимодействием с siRNA. Впервые из клетки пациента был выделен фрагмент РНК, показывающий, что mRNA была разрезана точно по нужному основанию благодаря механизму РНК-интерференции. Это доказывает, что такой механизм может использоваться для лечения людей.

«Существует много раковых мишеней, которые можно эффективно заблокировать в лабораторных условиях, используя siRNA, но сделать это в клинических условиях не удается», - говорит Антони Рибас (Antoni Ribas), адъюнкт-профессор медицины и хирургии в Центре исследований рака имени Джонссона Университета Калифорнии – Лос-Анджелес (UCLA's Jonsson Comprehensive Cancer Center). «Многие из таких мишеней невозможно заблокировать антиканцерогенными препаратами, созданными на традиционных принципах. Это исследование предоставляет первые доказательства того, что то, что работает в лаборатории, сможет в будущем помочь пациентам с помощью специфической доставки siRNA с использованием адресных наночастиц. Мы можем начать думать о достижении недостижимых сегодня целей».

«Хотя пока получены лишь первые результаты и необходимо продолжение исследований, эта работа по созданию новых противораковых средств, без сомнения, перспективна, и мы гордимся нашим вкладом в первые клинические испытания siRNA для лечения рака», - говорит Энтони Толчер (Anthony Tolcher), директор клинических исследований в South Texas Accelerated Research Therapeutics (START).

«Перспективные данные клинических исследований подтверждают, что рибонуклеотидная редуктаза является новой мишенью для разработки генной терапии рака», - добавляет один из соавторов работы Юнь Йень (Yun Yen). «Мы впервые видим пользу siRNA как средства для лечения рака и то, как нанотехнологии могут специфически доставлять их в раковые клетки».

Первый этап клинических испытаний – финансируемый Calando Pharmaceuticals – проходит в START и в Центре исследований рака имени Джонссона Университета Калифорнии – Лос-Анджелес. Клинические результаты испытаний будут представлены позднее. «По крайней мере, мы доказали, что механизм РНК-интерференции может быть использован для лечения людей и что системный подход с успехом может применяться для адресной доставки siRNA”, - говорит Дэвис. «И это очень волнительное время».

По материалам California Institute of Technology

Оригинал статьи

Researchers provide proof in humans of RNA interference using targeted nanoparticles

Биофункциональные наноматериалы для медицины и здоровья

Группа ученых под руководством Государственного университета Северной Каролины (North Carolina State University) опубликовала статью, описывающую использование технологии, называемой атомно-слоевым осаждением (atomic layer deposition), для придания биологической функциональности сложным наноматериалам, что может привести к созданию нового поколения материалов для применения в медицине и охране окружающей среды. Исследователи продемонстрировали, как эта технология может быть использована для разработки эффективных и недорогих приборов для очищения воды особенно необходимых в развивающихся странах.

«Атомно-слоевое осаждение – технология, используемая для получения тонких пленок для покрытия металлов и керамики, а также сложных наноразмерных структур», - говорит автор статьи доктор Роджер Нарайян (Roger Narayan). «В статье показано, как технология атомно-слоевого осаждения может быть использована для создания функциональных биоматериалов, имеющих, например, антибактериальные свойства. Другим примером является материал, который не реагирует с белками организма и необходим для разработки имплантируемых медицинских датчиков».

Одно из применений таких материалов – фильтры для очистки воды, описываемые в статье. «Они будут очень полезны в развивающихся странах или при чрезвычайных ситуациях – как на Гаити – где люди не имеют доступа к безопасной воде», - говорит Нарайян. «Доступа к безопасной воде не имеют более миллиарда людей на планете. Это приводит к целому ряду проблем общественного здравоохранения, включая холеру и гепатит».

В частности, ученые продемонстрировали, что атомно-слоевое осаждение может быть использовано для создания пленки для покрытия нанопористых мембран для фильтрации патогенных бактерий.

В ходе исследований ученые обнаружили, что покрытые одной из таких пленок мембраны способны нейтрализовать два распространенных патогена: кишечную палочку (E. Coli) и золотистый стафилококк (Staphylococcus aureus). Сейчас вместе со своими коллегами они работают над оценкой того, насколько хорошо мембраны могут противостоять целому ряду находящихся в окружающей среде бактерий. Предполагается, что такие мембраны могут найти применение в ряде областей медицины и охраны окружающей среды, в частности, в качестве фильтров для гемодиализа и имплантируемых сенсоров.

По материалам North Carolina State University

Оригинал статьи

Incorporating biofunctionality into nanomaterials for medical, health devices

Нанотехнологии на пути к созданию бионического глаза

Профессор Яэль Ханейн (Yael Hanein) из Школы электротехники Тель-Авивского Университета (Tel Aviv University's School of Electrical Engineering) провела основополагающее исследование, соединив нервы сетчатки с электродами для стимуляции клеточного роста. Показавшая себя успешной на животных моделях, в один прекрасный день эта методика вполне может заложить основу для создания имплантов сетчатки для людей.

Однако до этого еще далеко. Пока же ее наполовину человеческое и наполовину механическое изобретение используется разработчиками лекарств, исследующими новые соединения для лечения нежных нервных тканей мозга.

Статья об исследованиях профессора Ханейн и ее группы недавно опубликована в журнале Nanotechnology.

«Цель нашей работы - соединить созданную человеком технологию с нейронами», - говорит профессор Ханейн. «Это нужно для исследований как in vitro, так и in vivo и очень важно для понимания функционирования нейронов, что в конечном итоге поможет нам в разработке более совершенных приборов и лекарственных препаратов».

Ханейн разработала напоминающий спагетти массив углеродных нанотрубок и, используя электрический ток, сумела заставить живые нейроны мозга крыс расти на этой созданной человеком структуре. Рост живых клеток на наноразмерной подложке - очень сложный процесс, но клетки хорошо прикрепляются к структуре, сливаясь с синтетическим электрическим и физическим интерфейсом. Используя новую технологию, разработанную в лаборатории Ханейн, ее аспирант Марк Шейн (Mark Shein) наблюдает за тем, как взаимодействуют и функционируют нейроны.

«Мы пытаемся ответить на главные вопросы науки», - объясняет Ханейн. «Нейроны мигрируют и собираются вместе, и, применяя разработанный нами подход, мы теперь в состоянии «услышать», как они взаимодействуют друг с другом, используя электрические импульсы. Слушая «разговоры» нейронов, мы можем ответить на самые важные вопросы о том, как осуществляется взаимодействие между группами нейронов. Исследование функциональных нейронных сетей в лаборатории означает, что мы можем изучать то, что нельзя увидеть или услышать в целостном мозге, где слишком много одновременно возникающих сигналов».

Одно из применений разработки Ханейн - новый подход к оказанию помощи людям с дегенеративными заболеваниями сетчатки. Существует несколько неизлечимых заболеваний сетчатки, таких как пигментный ретинит, и сейчас некоторые исследователи изучают возможность применения протезного устройства, способного заменить поврежденные клетки.

«Нейроны любят формировать связи с нашими специальными наноматериалами, и сейчас мы изучаем возможность применения имплантов сетчатки», - говорит Ханейн. «Наши импланты - это попытка заменить функцию поврежденных клеток, а в случае болезней сетчатки, поврежденных фоторецепторов».

Самый крупный прорыв ученых – это создание таких искусственных «живых» устройств на основе пластичных наноматериалов, удобных для маленького пространства внутри глаза, где необходим рост новых нейронных связей. Это первый шаг в длительном процессе клинических испытаний, который может привести к улучшению зрения.

По материалам Tel Aviv University

Оригинал статьи

Seeing a bionic eye on medicine's horizon

Вглубь живой материи

Процесс сплайсинга РНК в режиме реального времени

Создавая блокбастер, режиссер фильма вырезает из него лишние кадры, а клеточная машина, называемая сплайсосомой, вырезает нежелательные участки генетического материала и соединяет оставшиеся участки, создавая шаблон для синтеза белка.

Но если сплайсосома делает это небрежно, может развиться болезнь.

Используя новый для изучения сплайсосом подход, группа ученых под руководством профессора химии и биофизики из Университета Мичигана (University of Michigan) Нилза Волтера (Nils Walter) в тесном сотрудничестве с группой, руководимой признанными всем мировым научным сообществом экспертами в области сплайсинга Джоном Абельсоном (John Abelson) и Кристин Гатри (Christine Guthrie) из Университета Калифорнии – Сан-Франциско (University of California, San Francisco), исследуют процесс сплайсинга в отдельной молекуле.

Статья будет опубликована в мартовском номере журнала Nature Structural and Molecular Biology.

С тех пор как за изучение процесса сплайсинга в 1977 году была присуждена Нобелевская премия, сплайсинг генов изучался на целом ряде организмов, включая дрожжи и клетки человека, с использованием как генетических, так и биохимических подходов. Хотя с помощью этих методов можно получить моментальные снимки, они не давали возможности наблюдать за процессом в реальном времени. Новое исследование, использующее технологию, называемую резонансным переносом энергии флуоресценции (fluorescence resonance energy transfer - FRET), и сложный микроскоп, дающие возможность увидеть движение в отдельной молекуле, позволило ученым наблюдать изменения, происходящие в процессе сборки и функционирования сплайсосом, в режиме реального времени.

По молекулярным стандартам сплайсосома - чудовищно большая машина, сделанная из пяти молекул РНК и 100 или более белковых субъединиц, которые шаг за шагом собираются в гигантский комплекс, когда сплайсосоме пора приступать к работе.

По аналогии с кинорежиссером сплайсосома не только выполняет функцию ножниц. Она также является «мозгом, который решает, какие кадры нужно вырезать», говорит Волтер. Материал, с которым работает такой «режиссер» - это генетический материал, заключенный в молекулах РНК. РНК содержит закодированные инструкции для производства белков, которые нужны нашему организму для строительства и восстановления тканей, регуляции процессов метаболизма, а также большое количество участков, называемых интронами. Задача сплайсосомы состоит в том, чтобы распознать и вырезать интроны. Когда интроны удалены, сплайсосомы могут склеивать экзоны в различных сочетаниях. Благодаря такому перемешиванию и склеиванию экзонов относительно небольшое число генов (чуть больше 20000 в человеческом организме) создает огромное многообразие белков.

Волтер и его коллеги проследили за процессом сплайсинга с помощью флуоресцентных меток, прикрепленных к экзонам по обе стороны от интрона, на коротких участках РНК, специально созданных для таких исследований. При освещении флуоресцентных меток лазерным светом, FRET может обнаружить, насколько близко или насколько далеко друг от друга располагаются экзоны. Повторяющиеся во времени наблюдения составляют в конечном итоге «кинофильм» молекулярного масштаба, из которого видно, как части молекулы РНК изменяются до и во время сплайсинга.

Сначала исследователи изучали РНК в отсутствии сплайсосом. Здравый смысл подсказывал, что сплайсосома сама направляет весь процесс сплайсинга, а молекула РНК мало влияет на этот процесс. Но они увидели изменения в самой молекуле РНК: за счет сжатия и растяжения интронов экзоны становились ближе друг к другу. Это предполагает более активную роль интронов.

Когда ученые добавили экстракт, содержащий компоненты сплайсосом и АТФ – источник энергии для их сборки – расстояние между экзонами сначала увеличилось, а затем стало даже меньше, чем до начала процесса. После таких изменений происходил собственно сплайсинг. Интересно, что последовательность событий, произошедших с молекулой РНК во время этого процесса, оказалась обратимой.

«Представьте, что у режиссера возникают сомнения, какие сцены из фильма нужно вырезать, и он многократно склеивает различные куски пленки, перед тем как прийти к окончательному решению. Все это мы и наблюдаем, только на молекулярном уровне», - говорит Волтер. «Насколько нам известно, наши данные - это первое прямое наблюдение обратимых конформационных изменений в процессе сплайсинга».

Далее исследователи планируют прикрепить флуоресцентные метки к различным частям системы, чтобы в процессе сплайсинга увидеть их пространственные и временные взаимосвязи. Конечной целью является построение комплексной модели, показывающей, каким образом РНК и сплайсосомы так точно взаимодействуют друг с другом, что избегают возникновения заболевания.

Исследование финансируется Национальным институтом здравоохранения (National Institutes of Health), Американским обществом рака (American Cancer Society) и другими организациями.

По материалам University of Michigan

Оригинал статьи

Spying on a Cellular Director in the Cutting Room

В лабораториях ученых

Секрет заживления хронических ран скрывается в «молчащих» РНК

Ученые пришли к выводу, что проблемы с заживлением хронических ран могут возникать из-за молекулярных структур, известных как РНК.

В новом исследовании на животных исследователи из Государственного университета Огайо (Ohio State University) открыли, что определенные фрагменты РНК в ране с ограниченным притоком крови снижают выработку белков, необходимых для стимуляции роста клеток кожи.

В параллельных исследованиях на клетках кожи человека ученые подавили фрагмент РНК экспериментальным препаратом и наблюдали повышение уровней белка. Количество клеток кожи, как результат, также увеличилось.

Такие результаты показывают, что воздействие на фрагменты РНК применяемыми местно лекарственными препаратами может стать новой стратегией лечения хронических ран, которые иногда оказываются фатальными и обходятся, например, системе здравоохранения США в 25 миллиардов долларов ежегодно.

Исследование будет опубликовано в он-лайн издании Proceedings of the National Academy of Sciences.

РНК в клетках ответственна за выполнение инструкций ДНК по выработке белков, но фрагменты РНК, обнаруженные в ходе данного исследования, играют совершенно другую роль. Это микроРНК (microRNA) - маленькие фрагменты РНК, блокирующие важный процесс сборки белков. В данном случае речь идет о miR-210.

Последнее исследование связано с ишемическими ранами. Заживление таких ран идет очень медленно либо вообще не наступает, так как на месте раны отмечается недостаточное кровоснабжение и пониженный уровень кислорода. Такие виды ран образуются у 6.5 миллиона пациентов ежегодно и обычно являются осложнениями диабета, гипертонии, ожирения и других заболеваний, которым свойственно плохое состояние сосудов.

«Когда кровоснабжение недостаточно, в тканях раны не хватает многих необходимых веществ, в том числе кислорода. Это приводит к состоянию, называемому гипоксией», - говорит Чэнден Сэн (Chandan Sen), профессор Государственного университета Огайо и руководитель исследования. «Мы обнаружили, что гипоксия вызывает образование miR-210, которые фактически блокируют способность клеток к пролиферации – шагу, необходимому для процесса заживления раны».

Лаборатория Сэна исследует влияние низких уровней кислорода на заживление ран в течение многих лет, но только сейчас ученые сумели определить всю последовательность событий, связывающих низкий уровень кислорода с подавлением клеточного роста. Сэн, являющийся также исполнительным директором Центра комплексных исследований ран Государственного университета Огайо (Comprehensive Wound Center at Ohio State University), утверждает, что это первая публикация, в которой молекулы микроРНК рассматриваются в качестве регуляторов процесса заживления хронических ран.

Для сравнения Сэн и его коллеги создали модели ишемической и не ишемической ран кожи у мышей.

Чтобы продемонстрировать, что раны получают различное количество крови, ученые применили ряд технологий, в том числе лазерную допплеровскую визуализацию и гиперспектральное сканирование. Кроме того, они использовали специальный датчик для измерения фактического уровня кислорода в ранах и показали, что уровень кислорода в ишемических ранах у мышей соответствует его уровню в хронических ранах у людей, наблюдаемых в клинических условиях.

В ишемических ранах у мышей ученые наблюдали, что гипоксические условия приводят к появлению определенного типа белка, называемого гипоксия- индуцибельным фактором-1а, или HIF-1a. Этот белок может «включать» и «выключать» гены и, в данном случае, вполне вероятно, влияет на поведение, по крайней мере, одного вида микроРНК.

Пометив маркерами эти вещества, ученые смогли наблюдать их взаимосвязь в ране. Присутствие HIF-1a в условиях пониженного содержания кислорода приводило к активации miR-210, а микроРНК, в свою очередь, понижали уровни белка, необходимого для начала активации клеток. Этот белок называется E2F3.

В противоположность этому не ишемические раны у мышей показывали нормальные уровни белка E2F3 и заживали в течение семи дней.

Для дальнейшего исследования этих взаимодействий ученые поставили эксперименты на линии клеток кожи человека, несущих основную ответственность на закрытие раны.

При нормальных уровнях кислорода ученые добились активации в клетках белка HIF-1a, появление которого в норме вызывается гипоксией. В присутствии HIF-1a клетки содержали высокие уровни miR-210, что, в свою очередь, понижало уровень белка E2F3.

Далее ученые изменили эти условия введением в клетки экспериментального препарата, названного антагомиром – синтетической молекулы, инактивирующей микроРНК, специально созданной для специфического взаимодействия с miR-210. С понижением уровня miR-210 с помощью антагомира уровень белка E2F3 поднялся, и рост клеток кожи значительно усилился. Когда же уровень miR-210 был искусственно поднят при помощи молекулы, имитирующей его поведение, рост клеток кожи подавлялся.

Появление микроРНК вызывается только определенными условиями. МикроРНК выполняют специфические функции в повседневной биологии любого органа, но в условиях травмы «просыпаются» определенные микроРНК. Если имеет место гипоксия, «просыпаются» miR-210, и затем уже именно они управляют тем, что происходит с белком E2F3.

«Антагомиры – растущая область научно-исследовательских разработок в фармакологии. Они рассматриваются как мощные агенты, противостоящие функционированию микроРНК во всем организме. Их использование для лечения ран, с другой стороны, может оказаться полезным с точки зрения возможности их местного применения», - говорит Сэн. Он планирует дальнейшие исследования их эффектов в экспериментах на животных.

По материалам Ohio State University

Оригинал статьи

Secret to Healing Chronic Wounds Might Lie in Tiny Pieces of Silent RNA