Выпуск No 40 от 2013-04-26

Герт Шиппингер^1,2, Карл Эттль³, Флориан Фанкхаузер², Штефан Шпирк^1,4, Вольфганг Домей⁵ и Петер Хофманн^1,4

¹Отдел исследования возможностей организма человека ^Грац, университет Граца и медицинский университет Граца,

² Центр спортивной хирургии Sportchirurgie Plus, Грац

³Научно-исследовательский центр физиологической химии, медицинский университет Граца,

⁴ Научно-исследовательский центр спортивных наук, университет Граца,

⁵Факультет внутренних болезней, медицинский университет Граца, Австрия

Общая информация

Обогащенная тромбоцитами плазма (PRP) с повышенным содержанием тромбоцитов и факторов роста была использована для лечения спортивных травм в связи с ее предполагаемым свойством стимулировать процессы заживления и регенерации. Данный метод является довольно многообещающим, особенно для элитных спортсменов. Однако применение инсулиноподобного фактора роста-1 (ИФР-1) запрещено Всемирным антидопинговым агентством, и, кроме того, существует предположение о существовании возможной взаимосвязи между повышением уровня ИФР-1 и риском развития онкологических заболеваний. Целью настоящего исследования являлась оценка повышения уровня ИФР-1 в общем кровотоке после местного внутримышечного введения PRP молодым, здоровым субъектам мужского пола, получающим умеренную тренировочную нагрузку. После забора образцов крови приготовление PRP осуществлялось при помощи центрифугирования.

Обогащенная плазма вводилась в ягодичную мышцу. Забор крови из вены и приготовление сыворотки осуществлялись как до, так и после (а именно через полчаса, 3 и 24 часа) введения PRP. Анализ ИФР-1 проводился при помощи тест-набора ELISA (тИФА). Значительного увеличения уровня ИФР-1 в общем кровотоке после инъекции PRP отмечено не было.

Только у одного субъекта через 24 часа после введения инъекции было зафиксировано повышение уровня ИФР-1, однако полученные значения, тем не менее, оставались в пределах референсного диапазона. Был сделан вывод о том, что однократное внутримышечное введение PRP не вызывает значительного повышения уровня ИФР-1 в системном кровотоке. Следовательно, однократное применение PRP является безопасным в отношении ответной реакции системного ИФР-1 и риска возникновения онкологических заболеваний, поэтому этот метод может быть использован для лечения травм мышц у элитных спортсменов.

Ключевые слова: Обогащенная тромбоцитами плазма, внутримышечное введение, ИФР-1, риск развития онкологических заболеваний, допинг

Введение

В последнее время наблюдается усиление тенденции к использованию  аутологичных препаратов крови в целях стимуляции процесса заживления при различных повреждениях, таких как травмы мышц, хронические тендинопатии и дегенерация хрящевой ткани (Baltzer et al., 2009; Banfi et al., 2006; Castricini et al. 2011; Creaney and Hamilton 2008, Volpi et al. 2010). Описанный потенциально перспективный метод представляет собой местное применение аутологичных концентратов тромбоцитов (Baltzer et al., 2009; Banfi et al., 2006; Mishra and Pavelko, 2006), известных также под названием обогащенной тромбоцитами плазмы (PRP) (Foster et al., 2009). Результаты ряда предварительных исследований свидетельствуют о возможном наличии преимуществ подобного применения PRP в терапевтических целях (Banfi et al., 2006; Baltzer et al., 2009, Mishra and Pavelko, 2006; Sánchez et al., 2009).

Однако эти данные еще не получили научного доказательства (Arnoczky et al., 2009). Упомянутый метод кажется очень многообещающим для спортсменов, однако существует ряд серьезных противоречий, касающихся проблем допинга, а также соответствующих положений кодекса Всемирного антидопингового агентства (WADA), которые на данный момент являются крайне мало изученными (WADA, 2011).

Метод PRP может быть определен как применение плазмы, концентрация тромбоцитов в которой превышает соответствующую концентрацию в цельной крови. Существует высокая вероятность того, что применение обогащенной плазмы, концентрация тромбоцитов в которой составляет как минимум 10⁹/л^-1, способствует процессу заживления (Marx, 2004). Концентрация тромбоцитов в ОТП в 4 раза превышает концентрацию тромбоцитов в цельной крови.

Основными биоактивными факторами, обнаруженными в тромбоцитах, являются трансформирующий фактор роста –β (ТФР-β), тромбоцитарный фактор роста (ТЦФР), инсулиноподобные факторы роста (ИФР-1, ИФР-2), фактор роста фибробластов (ФРФ), эпидермальный фактор роста, фактор роста эндотелия сосудов (ФРЭС) и фактор роста эндотелиальных клеток (ФРЭ). Эти цитокины играют важную роль в процессах клеточной пролиферации, хемотаксиса, дифференциации и ангиогенеза (Foster et al., 2009).

Несмотря на продолжающуюся полемику в отношении целесообразности применения PRP для регенерации костной ткани (Griffin et al., 2009; Ranly et al., 2007), все возрастающий объем лабораторных данных подтверждает эффективность этого метода в отношении лечения травм мышц и сухожилий (Sánchez et al., 2007, 2009b; Wright-Carpenter et al., 2004). Однако результаты недавнего рандомизированного контролируемого исследования, проведенного Castricini et al. (2011), не подтвердили гипотезу эффективности применения аутологичной обогащенной тромбоцитами фибриновой матрицы для лечения травм капсулы плечевого сустава.

Спортивные травмы мышечной ткани – очень частое явление, возникающее в результате прямого удара либо разрыва мышц. Для спортсменов быстрое восстановление является крайне важным, поэтому виды терапии, стимулирующие процесс заживления, вызывают значительный интерес (Lopez-Vidriero et al., 2010). Процесс заживления в любых органах и частях тела непосредственно связан со степенью васкуляризации тканей (Yokota et al., 2008). Скорость восстановления зависит от степени тяжести травмы, способов лечения травмы и врожденной способности организма пациента к регенерации поврежденных мягких тканей. Для сокращения восстановительного периода применяется

целый ряд методов. Было сделано предположение о том, что ОТП является потенциально эффективным терапевтическим мероприятием для лечения острых повреждений мышечной ткани у спортсменов (Lopez-Vidriero et al., 2010). Результаты одного из исследований in vitro свидетельствуют о том, что факторы роста могут оказывать влияние на посттравматическую регенерацию мышц (Kasemkijwattana et al., 2000). Применение обогащенной тромбоцитами плазмы может способствовать сокращению времени восстановления организма спортсмена после острой травмы мышечной ткани, однако рандомизированных контролируемых исследований, изучающих применение PRP при мышечных травмах, у людей не проводилось.

Однако, помимо возможного благоприятного воздействия PRP, существует еще ряд проблем, связанных с развитием нежелательных побочных явлений.

Особое внимание уделяется ИФР-1, поскольку он потенциально является допингом (Tentori and Graziani 2007) и может стать причиной канцерогенеза (Grimberg and Cohen, 2000; Grimberg, 2003, LeRoith and Roberts, 2003; Lann and LeRoith, 2008; Rowlands et al., 2009). Системный ответ некоторых факторов роста на единичное введение PRP уже был исследован Banfi et al. (2006), однако ИФР-1 данными авторами не изучался.

ИФР-1

Существуют как минимум три изоформы ИФР-1. Известно, что изоформа ИФР-1Ea стимулирует конечную дифференцировку мышечных клеток в мышечных трубочках и способствует опосредованной стволовыми клетками регенерации мышц. Механозависимый фактор роста или МФР (изоформа ИФР-1Ec) синтезируется в подверженных нагрузке или поврежденных мышцах, контролирует локальное восстановление тканей и чаще, чем ИФР-1Ea, является причиной возникновения гипертрофии мышц. МФР быстро разлагается в сыворотке (Philippou et al., 2007).

Уровень ИФР-1 в сыворотке у различных пациентов может варьировать в зависимости от генетической предрасположенности и состояния нутритивной обеспеченности организма. Типичные средние значения, упоминающиеся в результатах исследования субъектов мужского пола в возрасте 20 и 25 лет (Brabant et al., 2003), составляют 299 мкг/л^-1(диапазон нормальных значений 158(-2 СО) –497(+2СО) мкг/л^-1) и 230 мкг/л^-1 (диапазон нормальных значений 112 (-2СО) –402 (+2СО) мкг/л^-1) соответственно.

ИФР-1 и канцерогенез

В отношении канцерогенеза результаты исследований Creaney and Hamilton (2008) и Marx (2004) позволяют сделать вывод о том, что факторы роста воздействуют на рецепторы клеточной поверхности, но не проникают внутрь клетки и не вызывают мутаций ДНК. Поэтому, с точки зрения упомянутых авторов, не существует какого-либо механизма, посредством которого факторы роста могли бы стимулировать неопластические процессы. Несмотря на то, что до сегодняшнего дня каких-либо прямых доказательств опубликовано не было, существуют данные, указывающие на наличие определенной связи между повышением уровня ИФР-1 и развитием онкологических заболеваний. В обзорных статьях Grimberg и Cohen (2000) и Grimberg (2003) отмечается, что результаты многочисленных масштабных исследований сходных случаев свидетельствуют в пользу предположения о наличии взаимосвязи между повышением уровня ИФР-1 в системном кровотоке и риском развития различных видов злокачественных опухолей. Авторы, однако, отмечают, что эта гипотеза требует дальнейшей проверки посредством исследований механизма действия. Согласно данным систематического обзора и результатам регрессионного мета-анализа, осуществленного Renehan et al. (2004), значения концентрации ИФР-1 и ИФРСБ-3 (ИФР-связывающего белка) в кровотоке были связаны с повышением риска развития онкологических заболеваний, однако корреляция была слабой и варьировала в зависимости от научно-исследовательского центра, проводящего исследования.

ИФР-1 и проблемы допинга

В последнем официальном информационном письме WADA 2011 был отменен запрет на внутримышечное введение производных тромбоцитов (например, PRP, “прокручивание крови”) (WADA, 2011). Для применения любым из существующих способов требуется заполнение декларации об использовании в соответствии с Международным стандартом исключений, предоставляемых для терапевтического использования (TUE).

Тот факт, что ИФР-1 относится к классу S2 запрещенных WADA веществ, представляет собой серьезную проблему, вызвавшую волну бурных дискуссий среди специалистов, практикующих в области спортивной медицины.

Детальный анализ запрещенных веществ класса S2 показал, что, запрещенным является не только ИФР-1, но и ряд других факторов роста, оказывающих влияние на синтез/распад белка мышц, сухожилий и связок, васкуляризацию, использование энергии, регенерационную способность или переключение типа волокон. Исключение составляют внутримышечно применяемые препараты, обогащенные тромбоцитами (WADA, 2011) (Engebretsen et al., 2010).

Кроме того, результаты базовых научных исследований также свидетельствуют в пользу мнения о низкой вероятности возможности использования PRP в качестве эффективного эргогенического средства. Для обоснования приводятся следующие доводы:

∙Дозы ИФР-1 в PRP в 500 раз ниже доз, способных оказать анаболическое действие на системном уровне (300 нанограмм по сравнению с 160 мкг) (Creaney and Hamilton, 2008). При использовании ряда коммерческих PRP-систем, таких как ACP (Аутологичная измененная плазма), GPS (Гравитационное отделение тромбоцитов) и PRGF (Плазма, обогащенная факторами роста) увеличения уровня ИФР-1 в общем кровотоке выше предела нормальных значений не наблюдалось (Conway et al., 2006; Eppley et al., 2004; Buhr and Siekmann, 2009; Sánchez et al., 2007; Anitua et al., 2005).

∙Доступность основного объема ИФР-1 регулируется связывающим белком (ИФРСБ-3), и только 1% общего ИФР-1 в обогащенной плазме является несвязанным, а значит – биологически доступным, активным и способным связываться с рецепторами (ИФР-ИР), вызывая последствия на биологическом уровне. Кроме того, период полураспада несвязанного ИФР-1 слишком незначителен для того, чтобы тот успел оказать системное воздействие (10 минут по сравнению с 16 часами, характерными для связанной формы) (Foster et al., 2009).

∙Как правило, изоформа ИФР-1Ea, обнаруженная в PRP, не является причиной развития гипертрофии скелетных мышц (ИФР-1Ec/МФР) и может не оказывать такого же стимулирующего эффекта как вырабатывающийся в скелетных мышцах ИФР-1Ec (МФР) (Creaney and Hamilton, 2008).

Несмотря на то, что вероятность увеличения уровня ИФР-1 в системном кровотоке после единичной инъекции PRP крайне мала, данный важный фактор роста, насколько нам известно, до сих пор в упомянутом аспекте не изучался.

Задачей настоящего исследования являлось изучение возможного воздействия внутримышечно введенного PRP на уровень системного ИФР-1 в сыворотке здоровых субъектов в целях исключения потенциального риска (развития онкологических заболеваний) и внесения ясности в отношении проблем допинга. На основании литературных данных мы выдвинули гипотезу об отсутствии влияния единичных инъекций PRP на уровень ИФР-1 в системном кровотоке. Это может представлять интерес как для спортсменов элитного уровня, так и не для спортсменов, поскольку в подобном случае ни повышенного риска стимуляции канцерогенеза, ни риска получить положительные результаты при допинг-контроле в связи с явным повышением уровня ИФР-1 в кровотоке не существует.

Методы

В исследовании были изучены десять здоровых, получающих тренировочную нагрузку субъектов мужского пола в возрасте 23 ± 1,5 лет (VO_2max (МПК): 52,0 ± 11,1 мл/кг^-1/мин^-1; масса тела: 78,7 ± 9,3

кг, рост 1,84 ± 0,08 м). Все субъекты предоставили информированное согласие, а исследование было утверждено местным Комитетом по этике (№ 21-160ex 09/10).

До начала забора крови во внешний шприц двойной системы шприцев ACP (Arthrex®) набирали 1 мл раствора антикоагулянта цитрата декстрозы (NoClot 400^TM, Cytosol Laboratories, INC). Затем осуществляли забор 9 мл крови из срединной локтевой вены при помощи канюли типа «бабочка». Кровь была подвергнута обработке в центрифуге (Hettich Rotofix 32A) при скорости вращения 1500 об/мин в течение 5 минут для отделения плазмы от эритроцитов и лейкоцитов, после чего плазма была перемещена в маленький внутренний шприц посредством оттягивания вверх его поршня. Далее 2,5 мл аутологичной измененной плазмы (ACP) вводили в правую большую ягодичную мышцу каждого из субъектов.

Согласно официально предоставляемой производителям информации, продукт ACP содержит в 1,6 раз больше тромбоцитов (неопубликованный информационный документ, Arthrex®), в 2-6 раз больше факторов роста ЭФР (EGF), ФРЭС (VEGF), бета1-ТФР (TGF-ß1), бета2 –ТФР (TGF-ß2), ТРФР-АВ (PDGF-AB), ТРФР-ВВ (PDGF-BB), а также на 10% больше ИФР-1 по сравнению с соответствующими показателями цельной крови (Engebretesen et al. 2010).

Забор крови осуществлялся из одной и той же срединной локтевой вены. Для определения уровней ИФР-1 сыворотка была приготовлена до введения ACP, а также через 30 минут, 3 часа и 24 часа после введения АСР соответственно. В перерывах между обработкой образцы хранились при температуре -20C. Все субъекты были предупреждены о необходимости воздерживаться от физической нагрузки в течение как минимум двух дней до начала проведения исследования и в течение всего периода наблюдения. Оценка уровней ИФР-1 в сыворотке осуществлялась в двух повторностях при помощи тест-набора R&D Quantikine ELISA для определения уровня ИФР-1 у человека (Bio-medica, Вена, Австрия) в соответствии с инструкциями производителя. Выявленная внутрианалитическая сходимость находилась в установленных производителем пределах, т.е. от 3,5% до 4,3 % (Иммуноанализ для выявления ИФР-1 у человека, Quantikine, R&D Systems).

Непосредственного определения фактического количества тромбоцитов не осуществлялось, однако, согласно спецификации производителя, оно было в 1,6 раз больше по сравнению с количеством тромбоцитов в цельной крови (неопубликованный информационный документ, Arthrex®).

Статистический анализ

Результаты всех измерений приведены в средних значениях (±СО), а данные анализировались как нормально распределенные (критерий Колмогорова-Смирнова; Winstat, CalmiaCorp., США). Сопоставление значений уровней ИФР-1 до и после введения ACP осуществлялось посредством анализа ANOVA с повторными измерениями. Р-значение < 0,05 было определено как значимое. Необходимый объем выборки, составляющий 10 субъектов, был высчитан заранее при помощи аналитической программы G*Power (Faul et al., 2007) (при этом предполагаемая большая величина эффекта составляла 0,4 (Cohen, 1988), предполагаемый α-уровень – 0,05, а предполагаемая мощность - 0,8) и считался достаточным для имитации значимого увеличения уровня ИФР-1 по сравнению со средними значениями, характерными для этой возрастной группы (Brabant et al., 2003).

Результаты

Средние значения уровней ИФР-1, выявленные до введения АСР, соответствовали нижней границе нормального диапазона, характерного для данного возраста (161 ± 27 мкг/л^-1) согласно Brabant et al. (2003). Введение ACP не оказало влияния на средние значения ИФР-1 ни спустя 30 минут (157 ± 29 мкг/л^-1), ни спустя 3 часа (159 ± 25 мкг/л^-1), ни спустя 24 часа (161 ± 38 мкг/л^-1). Значимых выявляемых различий между группами (анализ ANOVA с повторными измерениями, p-значение > 0,05) не отмечалось. Динамика ИФР-1 у испытуемых была фактически сопоставимой, за исключением одного субъекта, у которого наблюдалось увеличение уровня ИФР-1 от 171 мкг/л^-1 перед введением ACP до 220 мкг/л^-1 через 24 часа после введения PRP. Все отдельные показатели находились в диапазоне нормальных средних значений ИФР-1, характерных для этой возрастной группы.

Обсуждение

Внутримышечное введение единичных инъекций ACP здоровым, получающим тренировочную нагрузку субъектам молодого возраста не оказало какого-либо влияния на уровни ИФР-1 в системном кровотоке. Только у одного субъекта отмечалось повышение уровня ИФР-1 через 24 часа после введения АСР по сравнению с исходным значением.

Однако упомянутые изменения все равно оставались в пределах диапазона нормальных значений, характерных для данной возрастной группы (Brabant et al., 2003).

Результаты ряда исследований позволяют сделать вывод о том, что PRP может успешно и эффективно применяться в спортивной медицине, однако объем данных, подтверждающих эту гипотезу, крайне незначителен и практически ограничивается данными, полученными в ходе маломасштабных исследований серий случаев. Большинство испытаний, проводимых с участием людей, представляют собой исследования 4-го и 5-го уровней, результаты которых продемонстрировали эффективность PRP при лечении тендинопатий (Arnoczky et al., 2009; Foster et al., 2009; Mishra and Pavelko, 2006; Sánchez et al., 2009a; 2009b). Необходимо проведение проспективных рандомизированных контролируемых двойных слепых исследований, отвечающих требованиям в отношении надлежащей их организации. Несмотря на упомянутый факт, авторы уверены, что в ближайшие десятилетия данную технологию ожидает колоссальное развитие и применение в новых областях деятельности.

ИФР-1 и канцерогенез

Одной из проблем может стать возможное канцерогенное действие ИФР-1 при условии, что применение PRP будет вызывать стабильное повышение уровней ИФР-1 относительно нормальных значений. Некоторые авторы сделали вывод о наличии взаимосвязи между повышением уровня ИФР-1 в системном кровотоке и риском развития различных видов онкологических заболеваний (Grimberg and Cohen, 2000; Grimberg, 2003, LeRoith and Roberts, 2003; Lann and LeRoith, 2008; Rowlands et al., 2009; Chen et al., 2009). Однако единичное внутримышечное введение PRP не обусловило повышения уровня ИФР-1 в системном кровотоке ни через 30 минут, ни через 3, ни через 24 часа после введения. С данной точки зрения единичные инъекции PRP оказались безопасным методом лечения, по меньшей мере, в рамках нашего исследования. Эффект многократных инъекций в данном исследовании не изучался, однако отсутствие повышения уровня ИФР-1 у 10 субъектов и тот факт, что в большинстве  PRP-систем ИФР-1 не концентрируется (Anitua et al., 2005; Buhr and Siekmann, 2009; Conway et al., 2006; Eppley et al., 2004; Sánchez et al., 2007), позволяют сделать предположение об отсутствии канцерогенного действия, обусловленного повышением уровней ИФР-1 в результате многократных инъекций.

IGF-1 и проблемы допинга 

Серьезной проблемой стал тот факт, что применение PRP в спортивной медицине было раскритиковано Всемирным антидопинговым агентством, в частности, в связи с ИФР-1, содержащимся в таких препаратах, и возможным злоупотреблением их в качестве стимулирующих средств/допинга. Несмотря на отсутствие экспериментально полученных доказательств, не так давно было выявлено, что вероятность повышения уровней ИФР-1 в системном кровотоке в результате применения PRP-продуктов крайне мала (Creaney and Hamilton. 2008). Необходимо подчеркнуть, что применение экзогенного ИФР-1 помимо PRP, в качестве стимулятора, по-прежнему запрещено антидопинговым кодексом WADA (класс S2).

В течение последних двух десятилетий гормоны роста получили значительную популярность в связи с наличием рекомбинантных форм и сегодня широко используются в спортивном мире (Saugy et al., 2006; Sonkens, 2001; Stay et al., 2004). В настоящее время многих спортсменов, таких как велосипедисты, пловцы и бодибилдеры, подозревают в применении рекомбинантных ГР или ИФР-1 для достижения желаемого анаболического эффекта (Stay et al., 2004; Saugy et al., 2006; Sonkens, 2001). Результаты настоящего исследования показали, что стандартизированный метод внутримышечного введения единичных инъекций PRP не вызывает повышения уровня ИФР-1 в системном кровотоке и, следовательно, может считаться неэффективным в отношении стимуляции последствий на системном уровне. Эти результаты согласуются с мнением Creaney and Hamilton (2008), согласно которому вероятность возможности использования PRP в качестве эффективного эргогенического средства крайне мала, поскольку период полураспада несвязанного ИФР-1 слишком незначителен для того, чтобы тот успел оказать системное воздействие, а дозы ИФР-1 в PRP слишком малы для того, чтобы оказать анаболическое действие на уровне всего организма, даже в случае отсутствия задержки выделения факторов роста как, например, в проводимом нами исследовании. На основании результатов своего исследования Volpi et al. (2010) сделали вывод о том, что местное применение препарата на основе PRP может оказать влияние на системный гомеостаз и результаты антидопинговых оценочных мероприятий, однако, по их мнению, сам по себе допингом он не является. У данного исследования имелись ограничения, заключающиеся в незначительности объема выборки и в том, что оценке подвергался только ИФР-1, а не ряд факторов роста (Banfi et al., 2006). Дополнительным ограничивающим обстоятельством может считаться тот факт, что в применяемом нами продукте АСР не измерялось фактическое количество ИФР-1. Результаты предыдущих исследований подтверждают увеличение концентрации тромбоцитов в 2-3 раза и повышение уровней факторов роста, в том числе ИФР-1, в продукте ACP (неопубликованный информационный документ – Athrex®). Кроме того, на основании наших данных нельзя исключить того, что в травмированной мышечной ткани метаболизирование происходит по-другому.

Выводы

Существуют определенные опасения, касающиеся применения ИФР-1, например, опасения в отношении его канцерогенного потенциала, и, что важнее, в отношении проблем допинга у спортсменов. Во многих аспектах метод PRP представляет значительный интерес для лечения спортивных травм, позволяя стимулировать и ускорять процессы физиологичного заживления и функционального восстановления спортсменов. С января 2011 года кодексом WADA разрешено его местное внутримышечное применение.

Полученные нами данные свидетельствуют об отсутствии повышения уровня ИФР-1 в системном кровотоке после одной единичной местной внутримышечной инъекции PRP. Следовательно, как профессиональные спортсмены, так не лица, не являющиеся спортсменами, могут пользоваться преимуществами, которые дает применение такого метода терапии для лечения повреждения мышц и соответствующих спортивных травм, без повышения риска развития онкологических заболеваний. Однако для получения убедительных и окончательных доказательств, на которые врач мог бы опираться при принятии решения в отношении применения продуктов PRP, необходимо проведение большего количества исследований.

 Благодарность

Авторы выражают благодарность Джулии Крепфль за ее помощь в проведении статистического анализа.

Финансирование:

Финансирование исследования осуществлялось компанией Arthrex®, производящей системы для приготовления PRP (ACP®) для применения в терапевтических целях.

Список литературы

Anitua, E., Andía, I., Sanchez, M., Azofra, J., del Mar Zalduendo, M., de la Fuente, M., Nurden, P. and Nurden, AT. (2005) Autologous preparations rich in growth factors promote proliferation and induce VEGF and HGF production by human tendon cells in culture. Journal of Orthopaedic Research 23(2),281-286.

Arnoczky, S.P., Anderson, L., Fanelli, G., Ho, S., Mishra, A. and Scgalione, N. (2009) The role of platelet-rich plasma in connective tissue repair. Orthopaedics Today 26,29.

Baltzer, A.W., Moser, C., Jansen, S.A. and Krauspe, R. (2009) Autologous conditioned serum (Orthokine) is an effective treatment for knee osteoarthritis. Osteoarthritis and Cartilage 17, 152-160.

Banfi, G., Corsi, M.M. and Volpi, P. (2006) Could platelet rich plasma have effects on systemic circulating growth factors and cytokine release in orthopaedic applications? British Journal of Sports Medicine 40, 816.

Brabant, G., von zur Mühlen, A., Wüster, C., Ranke, M.B., Kratzsch, J., Kiess, W., Ketelslegers, J.M., Wilhelmsen, L., Hulthén, L., Saller, B., Mattsson, A., Wilde, J., Schemer, R. and Kann, P. (2003) Serum insulin like Growth Factor 1 Reference Values for an Automated Chemiluminescence Immunoassay System: Results from a Multicenter Study. Hormone Research 60, 53-60.

Buhr, M. and Siekmann, W. (2009) Intra-articular Injection of Platelet Rich Plasma for cartilage repair. Orthopädische Praxis 45(1), 10-16.

Castricini, R., Longo, U.G., De Benedetto, M., Panfoli, N., Pirani, P., Zini, R., Maffulli, N. and Denaro, V. (2011) Platelet-rich plasma augmentation for arthroscopic rotator cuff repair: a randomized controlled trial. The American Journal of Sports Medicine 39, 258-265.

Chen, B., Liu, S., Xu, W., Wang, X., Zhao, W. and Wu, J. (2009) IGF-1and IGFBP-3 and the risk of lung cancer: A meta-analysis based on nested case-control studies. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 28, 89.

Cohen, J. (1988) Statistical power analysis for the behavioral sciences. 2^nd edition. Lawrence Erlbaum Associates. Conway, K., Price, P., Harding, K.G. and Jiang, W.G. (2006) The molecular and clinical impact of hepatocyte growth factor, its receptors, activators, and inhibitors in wound healing. Wound Repair and Regeneration 14, 2-10.

Creaney, L. and Hamilton, B. (2008) Growth factor delivery methods in the management of sports injuries: the state of play. British journal of Sports Medicine 42, 314-320.

Engebretsen, L., Steffen, K., Alsousou, J., Anitua, E., Bachl, N., Devilee, R., Everts, P., Hamilton, B., Huard, J., Jenoure, P., Kelberine, F., Kon, E., Maffulli, N., Matheson, G., Mei-Dan, O., Menetrey, J., Philippon, M., Randelli, P., Schamasch, P., Schwellnus, M., Vernec, A. and Verrall, G. (2010) IOC consensus paper on the use of platelet-rich plasma in sports medicine. British journal of Sports Medicine 44, 1072-1081.

Eppley, B.L., Woodell, J.E. and Higgins, J. (2004) Platelet quantification and growth factor analysis from platelet-rich plasma: implications for wound healing. Plastic and Reconstructive Surgery 114(6), 1502-1508.

Faul, F., Erdfelder, E., Lang, A-G. and Buchner, A. (2007) G*Power 3: A flexible statistical power analysis program for the social, behavioral, and biomedical sciences. Behavior Research Methods 39, 175-191.

Foster, T.E., Puskas, B.L., Mandelbaum, B.R., Gerhardt, M.B. and Rodeo, S.A. (2009) Platelet-rich plasma: from basic science to clinical applications. The American Journal of Sports Medicine 37, 2259-2272.

Griffin, X.L., Smith, C.M. and Costa, M.L. (2009) The clinical use of platelet rich plasma in the promotion of bone healing: A systematic review. Injury 40, 158-162.

Grimberg, A. and Cohen, P. (2000) Role of insulin-like growth factors and their binding proteins in growth control and carcinogenesis. Journal of Cellular Physiology 183, 1-9.

Grimberg, A. (2003) Mechanisms by which IGF-1 may promote cancer. Cancer Biology & Therapy 2, 630-635.

Kasemkijwattana, C., Menetrey, J., Bosch, P., Somogyi, G., Moreland, MS., Fu, F.H., Buranapanitkit, B., Watkins, S.S. and Huard, J.(2000) Use of growth factors to improve muscle healing after strain injury. Clinical Orthopaedics and Related Research 370, 272-285.

Lann, D. and LeRoith, D. (2008) The role of endocrine insulin-like growth factor-1 and insulin in breast cancer. Journal of Mam-mary Gland Biology and Neoplasia 13, 371-379.

LeRoith, D. and Roberts, C.T. (2003) The Insulin-like growth factor system and cancer. Cancer Letters 195, 127-137.

Lopez-Vidriero, E., Goulding, K.A., Simon, D.A., Sanchez, M. and Johnson, D.H. (2010) The use of platelet-rich plasma in arthroscopy and sports medicine: optimizing the healing environment. Arthroscopy 26, 269-278.

Marx, R.E. (2004) Platelet-rich plasma: evidence to support its use. J Oral and Maxillofacial Surgery 62, 489-496.

Mishra, A. and Pavelko, T. (2006) Treatment of chronic elbow tendinosis with buffered platetelet-rich plasma. The American Journal of Sports Medicine 34, 1774-1778.

Philippou, A., Maridaki, M., Halapas, A. and Koutsilieris, M. (2007) The role of insulin-like growth factor 1(IGF-1) in skeletal muscle physiology. In Vivo 21, 45-54.

Ranly, D.M., Lohmann, C.H., Andreacchio, D., Boyan, BD. and Schwartz, Z. (2007) Platelet rich plasma inhibits demineralized bone matrix-induced bone formation in nude mice. The Journal of Bone And Joint Surgery. American Volume 89, 139-146.

Renehan, A.G., Zwahlen, M., Minder, C., O'Dwyer, S.T., Shalet, S.M. and Egger, M. (2004) Insulin-like growth factor (IGF)-1, IGF binding protein-3, and cancer risk: systematic review and metaregression analysis. Lancet 363, 1346-1353.

Rowlands, M.A., Gunnell, D., Harris, R., Vatten, L.J., Holly, J.M. and Martin, R.M. (2009) Circulating insulin-like growth factor peptides and prostate cancer risk: a systematic review and meta-analysis. International Journal of Cancer

124, 2416-2429.

Sánchez, M., Anitua, E., Azofra, J., Andía, I., Padilla, S. and Mujika, I. (2007) Comparison of surgically repaired Achilles tendon tears using platelet-rich fibrin matrices. The American Journal of Sports Medicine 35, 245-251.

Sanchez, M., Anitua, E., Cugat, R., Azofra, J., Guadilla, J., Seijas, R. and Andia, I. (2009a) Nonunions treated with autologous preparation rich in growth factors. Journal of Orthopaedic Trauma 23, 52-59.

Sánchez, M., Anitua, E., Orive, G., Mujika, I. and Andia, I. (2009b) Platelet-rich therapies in the treatment of orthopaedic sport injuries. Sports medicine 39, 345-354.

Saugy, M., Robinson, N., Saudan, C., Baume, N., Avois, L. and Mangin, P. (2006) Human growth hormone doping in sport. British Journal of Sports Medicine 40, 35-39.

Sonksen, P.H. (2001) Insulin, growth hormone and sport. The Journal of endocrinology 170, 13-25.

Stay, J.J., Terrell, T.R. and Armsey, T.D. (2004) Ergogenic aids: human growth hormone. Current Sports Medicine Reports 3, 229-233.

Tentori, L. and Graziani, G. (2007) Doping with growth hormone/IGF-1, anabolic steroids or erythropoietin: is there a risk? Pharmacological Research 55, 359-369.

WADA. (2011) The 2011 Prohibited List World Anti-Doping Code. Available from URL http://www.wada-ama.org/Documents/World_Anti-Doping_Program/WADP-Prohibited-list/To_be_effective/WADA_Prohibited_List_2011_EN.pdf

WADA. (2008) World Anti-Doping Agency. Available from URL: http://www.wada-ama.org (accessed 2008 Mar 16).

Volpi, P., Quaglia, A., Schoenhuber, H., Melegati, G., Corsi, M.M., Banfi, G. and de Girolamo, L. (2010) Growth factors in the management of sport-induced tendinopathies: results after 24 months from treatment. A pilot study. The Journal of Sports Medicine and Physical Fitness 50, 494-500.