сайт Института Новых Медицинских Технологий

Перейти на главную страницу и скачать книгу можно по ссылке:

http://www.medserver.nm.ru

 

Репин В.С., Ржанинова А.А., Шаменков Д.А.

Эмбриональные   стволовые   клетки:

            

Фундаментальная биология и медицина

Москва

2002

 

Оглавление:

ГЛАВА 1 Эмбриональные стволовые клетки: фундаментальные исследования

1. На пороге новой биологии и медицины 2. ЭСК: основные определения и концепция 3. Основные источники и способы выделения ЭСК (историческая справка) 4. Молекулярные основы тотипотентности генома ЭСК 5. Особенности фенотипа ЭСК 6. ЭСК – модель для изучения геномики раннего эмбриогенеза и органогенеза 7. Направленная дифференцировка ЭСК и ППК in vitro 8. ЭСК в изучении функций  Нох-генов 9. ЭСК  - новый биоресурс  медицины 10. ЭСК: законодательство и биоэтика 11. Мост между наукой и клиникой 12. Литература

5 8 26 46 50 55   60 69 71 79 83 86

 

ГЛАВА 2 Стволовые клетки в эмбриогенезе мозга млекопитающих

1. Модели  на стыке клеточной биологии и геномики 2. Нервная трубка - первоисточник провизорных стволовых клеток 3. Стволовое пространство обонятельного нейроэпителия 4. Стволовое пространство эпендимы 5. Клональная дисперсия стволовых клеток мозга 6. Регионализация и сегментация нервной трубки 7. Первичный нейро - и глиогенез 8. Направленная миграция прогениторных клеток: взаимодействие с радиальной глией 9. Нейрональные стволовые клетки in vitro 10. Методические трудности получения  клонов НСК из ЭСК 11. Получение нейронов  из ЭСК 12. Получение  линий   НСК 13. Трансплантация НСК/прогениторных клеток в развивающийся мозг эмбрионов 14. Трансдифференцировка  НСК после трансплантации 15. Нейромезенхимальные стволовые клетки нервного гребня 16. Литература   Коллектив авторов

96 98 105 107 109 110 119 121   125 133 135 138 147   148 149 162   176

 

 

ГЛАВА ПЕРВАЯ

 

Эмбриональные стволовые клетки:

фундаментальные исследования

 

 

 

 

 

Природные силы внутри нас являются наилучшими целителями болезней

Гиппократ

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. На пороге новой биологии и медицины

 

Поражающее разнообразие  многоклеточных имеет весьма скромное начало в одной оплодотворенной яйцеклетке. Много поколений биологов и эмбриологов размышляло над загадкой, каким образом генетическая информация    одной клетки макромасштабируется  в сотни миллионов клеток нового зародыша.

Экспериментальный прогресс сдерживался тем, что яйцеклетки, зиготы и бластомеры не удавалось перевести в бессмертные линии, получив таким способом клеточный материал в количествах, достаточных для изучения спектров мРНК и белков (Weismann, 2000). Только эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) – пролиферирующие «дублеры» зиготы -  стали новым ресурсом  клеток, стоящих у истоков развития.  Наука сделала первый шаг к  лабораторной ткани, повторяющей соматический эмбриогенез млекопитающих в обход гамет и оплодотворения. Тотипотентность – это свойство генома клеток макромасштабировать программы эмбриогенеза, в том числе воспроизводить любую из 250 специализированных клеток взрослого организма.  Подобно зиготе и первым клеткам зародыша, ЭСК в простых условиях культуры воспроизводят «лабораторный» эмбриогенез в два этапа. Сначала микрограммовые количества “клеток без фенотипа” пассируют в миллиарды клеток. Затем незрелые постмитотические клетки с помощью набора химических инструкций in vitro видоизменяют в клетки мозга, сердечной, скелетной мышцы, печени и т.п. Получение соматических клеток из ЭСК идет в обход органогенеза и многих событий, происходящих при естественном развитии зародыша в матке.  Как известно, специализированные клетки взрослого организма необратимо утрачивают способность к повторению эмбриогенеза. В культуре большинство специализированных клеток, изолированных из тканей, быстро дедифференцируются,  теряя фенотип и профиль функций. Науке пока не известны способы получения стволовых клеток из дифференцированных клеток. ЭСК - это  эмбриогенез  без  половых клеток и беременности. 

 ЭСК – незаменимая модель для  функциональной постгеномики. Кардиомиоциты, миоциты, клетки крови и иммунной системы являются полными автоматами. Поведение ЭСК определяется взаимодействием внешних сигналов  с эпигеномной  системой   клеток, имеющих уникальную протеомику и огромное «меню» из предсинтезированных мРНК. На клетках ЭСК с максимально простым фенотипом  легче анализировать  главный алгоритм онтогенеза: как soft сигналы  непрерывно изменяют hard- устройство клеток.  В отличие от молекулярной генетики, изучавшей функции отдельных генов, постгеномика занимается протеомикой целостных белковых сетей (как soft-сети собирают клеточные устройства). Интегральные белковые сети - платформа целенаправленного поведения клеток в виде альтернативных ответов. Адекватный выбор сигналов и ответы  ЭСК заставляют признать, что  клетки имеют элементарный интеллект для распознания, выбора сигналов, их селективной переработки. Селективный отбор сигналов транслируется далее в паттерны поведения клеток. Поведение клеток и его нарушение является конечной целью современной медицины. Этот уровень знаний дает новые инструменты  для разгадок  болезней клеток и старения.

Другая важная особенность генома ЭСК – спонтанная частота мутаций  ниже в несколько раз, чем у  соматических клеток. Внутрихромосомная рекомбинация и эндоредупликация отдельных сегментов хромосом полностью блокированы устройством хроматина. Генетическая нестабильность хромосом и анеуплоидия в пассажах характерны только для линий тератокарциномы и эмбриокарциномы (Servantes R.B., Stringer J.R., Tischfield J.A.,2002). Эта особенность организации хроматина делает маловерятными случайные перестройки хромосом, связанные с малигнизацией трансплантированных  ЭСК-дериватов.

Cтволовая ниша –  стабильное микроокружение вокруг каждого клона ЭСК, создаваемое монослоем так называемых фидерных клеток.   Трофобласт служит фидером для эмбриобласта у предимплантационных зародышей млекопитающих. Клетки хориоидного сплетения служат питательной, защитной и информационной средой для нейральных стволовых клеток эпендимы развивающегося мозга. Эндотелиальные синусы, либо капиллярная сеть служат нишей для региональных стволовых клеток органов и тканей, в том числе для мезенхимальных стволовых клеток. По этой причине все ранние ЭСК зародыша выращивают в суспензии над монослоем фидерных стромальных клеток, которые обеспечивают незрелые плюрипотентные клетки всем необходимым для выживания и самообновления.

В настоящее время ЭСК нужны не только для расшифровки кодов пред- постимплантационного развития, но и лабораторного  воспроизводства  клеток органов в обход беременности. Получить миниорганы in vitro – более трудная задача, чем получить дифференцированные клетки тех же органов. Клетки -дублёры зиготы необходимы для биоэтически допустимых экспериментов. ЭСК не являются зародышем, не имеют статуса «новой жизни», поскольку получены в обход оплодотворения и беременности. Сохраняя ранг клеток, ЭСК являются чем-то большим: они серийно копируют органогенез. Они  незаменимы для изучения стыков развития  клетка/орган/ткань. Пока наука не имеет достаточной платформы, чтобы окончательно определить юридический/ биоэтический статус  ранних зародышей, эмбрионов и плодов. Отсутствие законодательной базы относительно всех периодов жизни человека   существенно влияет на принятие практических решений в области репродукционного и терапевтического клонирования. Биоэтические посылки многих высокоразвитых стран, утверждающих статус новой жизни и личности с момента  зачатия и появления зиготы, идут вразрез с принятым законодательством, признающим права новой жизни лишь с момента рождения.  Согласование этих вопросов на уровне государств и международных институтов (ООН, Совет Европы и т.п.) имеет первостепенное значение для свободного развития  биологии и медицины. Как известно, права на новые исследования и знания могут быть ограничены, если   человек или зародыш не становятся  средством  в руках других людей.

Биологи в современном обществе вынуждены отстаивать право на новые границы знаний и новые технологии. Развитие зиготы в зародыш воспроизводится в лаборатории. Многие представители религии настаивают, что создание/разрушение ранних зародышей в лаборатории недопустимо. В то же время в США и многих странах разрешено платное донорство яйцеклеток (1500-2000 долларов в США), которое открыло путь к внеполовому получению ранних зародышей. Один работающий  банк спермиев и яйцеклеток  в Норфолке (Канада) способен обеспечить работу  всех биотехнологических компаний с искусственными бластоцистами для изолирования линий ЭСК.  Бластоцисты сейчас можно получить путем переноса ядра соматической клетки заказчика в зрелую донорскую яйцеклетку, из которой предварительно был удален пронуклеус. Лабораторные банки тотипотентных клеток уже создали техногенную эмбриологию и альтернативу половому процессу не с целью повторного воспроизводства копий уже живших людей, а  с целью лечения миллионов пациентов на планете.  Согласно  прогнозу,   в 2020-2030 годах примерно треть пациентов будет получать лечение в виде пересадок дериватов ЭСК. Не размышления, а единственно возможная помощь погибающему пациенту – это императив биоэтики у постели больного (особенно у фатально обреченных). Стремление помочь  склоняют врача к лабораторному клонированию клеток пациента, как к последнему эффективному средству помощи. Аморальным в наше время становится не использовать ЭСК для создания банка резервных клеток каждого человека на случай заболевания. Наиболее гуманная биоэтика заставляет остальное общество видеть проблему прежде всего глазами и нуждами больных людей и их ближайших родственников. Каждый пациент имеет право на спасение и новые формы лечения. Наука и общество должны развивать медицину, дающую новый шанс на выживание или продление жизни   существующим на земле поколениям. Новые реалии медицины сильно изменили вектор дискуссий вокруг ЭСК.

В XIV веке происходили ожесточенные теологические споры о возможности посмертных вскрытий с целью изучения внутренних органов и причин заболеваний. Всего несколько врачей того столетия посмели создать секционный зал. Без этих пионеров в следующем веке не было бы анатомического атласа и великих открытий Леонардо. Морфология стала первой королевой медицины XV века.  В XXI  веке на стыке клеточной биологии ЭСК с функциональной постгеномикой  рождается новое будущее   медицины XXI века. Неизбежно разгораются  споры и дискуссии, а знания обрастают мифами и предубеждениями в обществе.

 

2. ЭСК: основные определения и концепция

 

Все специализированные клетки взрослого организма происходят из стволовых клеток. Стволовые клетки – это «запасники», «НЗ» информации развития (эмбриогенеза). Эту информацию развития нельзя свести с генам, поскольку каждый этап развития не запрограммирован автоматически, а связан с утилизацией сигналов и эпигенетической информации. ЭСК – это программа и процессор информации одновременно. Программы развития сильно меняются в зависимости от окружающей среды. Своевременное обновление репертура здоровых клеток является незаменимым условием здоровья и долголетия многоклеточного организма. Все органы взрослого человека и млекопитающих сохраняют «реликты» зародышевой ткани в виде микровкраплений стволовых клеток. Стволовые клетки – орган срочной макрорепарации при массированном повреждении ткани. Одновременно стволовые клетки – это аппарат обновления, смены устаревших «больных» клеток, в том числе для защиты от преждевременного старения. ЭСК позволяют избавиться от больных клеток не с помощью лекарств, а путем своевременной смены клеток.

Главная идея молекулярной медицины – найти лекарство для излечения больных клеткок - выглядит привлекательной, но непрактичной. Если в больном органе блокировано самообновление клеток, то накапливается множество аномальных клеток разного фенотипа. В этом случае понадобилось бы миллион «волшебных пуль» для нормализации миллиона разных больных клеток.   Часто  функциональная паренхима  органов замещается   производными мезенхимы (фиброз, атеросклеротические бляшки, глиоз и т.д.). Только факторы своевременной регенерации паренхимы способны защитить органы от повсеместного разрастания соединительной ткани.

 

 

Рис 1-1 Лабораторные пути получения дериватов тканей человека из тотипотентных ЭСК и ППК

 

В геноме соматических клеток отсутствуют «программы» лечения. Геномика  аномальных клеток использует  несколько вариантов  апоптоза для аутоэлиминации ненормальных клеток. С  другой стороны  пересадки СК ускоряют самообновление клеток в органах, в том числе элиминацию  патологически измененных клеток.

Для исследователей ЭСК- это  «шпаргалка» для расшифровки работы генома (особенно в период раннего эмбриогенеза и органогенеза). Необходимо напомнить, что  изучение эмбриогенеза человека ограничено по биоэтическим соображениям. Постимплантационный эмбриогенез млекопитающих мышей, крыс, других лабораторных млекопитающих имеет существенные отличия. Во многих ситуациях ЭСК остаются единственной экспериментальной возможностью для моделирования событий, происходящих в зародыше человека после имплантации. Таким образом, ЭСК человека и млекопитающих – незаменимый путь для изучения   аномалий постимплантационного развития зародышей. Самые ранние события кардиогенеза, миогенеза, нейрогенеза с дешифровкой soft-программ  самосборки клеток в органы доступны пока лишь в культуре ЭСК (Kehat I., Kenyagin-Karsenti D., Snir M. Et al.,2001).

 Для ЭСК характерно два варианта запрограммированного поведения в культуре. 1) незрелые ЭСК длительно размножаются  в присутствии фидерного слоя клеток и ростовых факторов. 2) после наработки  массы недифференцированных клеток, рамножение клеток останавливают, изменяя условия культивирования. Начинается дифференцировка клеток  (желательно в один тип специализированных клеток) .  (Рис 1-1)

ЭСК  назвали "лабораторными лошадками" регенерации (Petit-Zeman, 2001), потому что  регенерация органов практически невозможна за счет резерва собственных дифференцированных клеток. ЭСК  «банкируются» in situ и повторяют фрагменты эмбриогенеза в тканях взрослого организма. Некоторые линии ЭСК человека  удавалось пассировать без изменения фенотипа более 2 лет. Такие культуры прошли 300-450 циклов удвоения клеток без возникновения анеуплоидии или опухолей. При устранении фидера, ростовых факторов, а также после добавления сигналов начиналась медленная многоэтапная дифференцировка ЭСК в популяции дефинитивных, необратимо специализированных клеток. Интересно, что дифференцировка ЭСК в нейроны, кардиомиоциты идет за 10-15 дней, тогда как аналогичные процессы линейного созревания клеток в эмбрионе идут 5-7 нед (Kawasaki H., Suemori H., Mizuseki K. et al.,2002). В последнее время стали использовать сигналы фидерного слоя клеток для ускоренной дифференцировки клеток в культуре.

В зародыше и взрослом организме потенции генома стволовых клеток  существенно варьируют по  "ассортименту" фенотипа специализированных клеток. Более ранние, тотипотентные ЭСК дифференцируются в любую из 250 линий специализированных клеток органов. Необходимо подчеркнуть, что ЭСК in vitro не продуцируют клеток трофобласта, плаценты, т.е.  потенции генома ЭСК меньше зиготы.. Соответственно биологический статус ЭСК меньше статуса раннего зародыша.   Плюрипотентные ЭСК дают более ограниченный спектр фенотипов. Например, мезенхимальные стволовые клетки (МСК), локализованные в опорно-сосудистом каркасе  органов, дифференцируются в культуре только в клетки хряща, кости, кардиомиоциты и миоциты. Монопотентные стволовые клетки (мышц, жировой ткани, периферических нервов) созревают до одного преобладающего фенотипа клеток. Стволовые региональные клетки взрослого организма наделены мультипотентностью-  пластичной плюрипотентностью, которая сильно варьирует в контексте органа-реципиента. Так, пересадки гематогенных стволовых клеток в мозг, сердечную или скелетную мышцу приводили к образованию ткане-специфичных ростков донорской ткани в органах реципиента. Однократное переливание 0,5 л донорской женской крови  мужчине-реципиенту химеризует женскими клетками все паренхиматозные органы (Korbling M., Katz R.L., Khanna A. et al., 2002). Большое внимание уделяется сейчас мультипотентным МСК взрослых органов, поскольку эти клетки хорошо мигрируют и   многократно химеризуют ткани. В свою очередь, пересадки нейрональных стволовых клеток в печень, мышцу или иммунную систему сопровождались тканеспецифичной перестройкой фенотипа донорских клеток. Хорошо доказано,  что сигналы микроокружения играют решающую роль в судьбе трансплантированных ЭСК/МСК in situ. Существенно, что ЭСК/МСК при дифференцировке в культуре давали лишь "природные" линии дифференцированных клеток, которые встречались в организме взрослого животного и человека. Никаких новых типов клеток или неизвестных линий дифференцированных клеток из ЭСК не возникало  in vitro (O'Shea, 1999). Наблюдения подтверждены  другими многочисленными работами, что снижает риск осложнений и повышает безопасность клеточной терапии дериватами стволовых клеток.