Некоторые аспекты культивирования и трансплантации культур фибробластов человека

К.б. наук А.Н.Петров, Институт Клеточных Технологий

Полную версию См. на сайте: http://www.medlink.nm.ru/stemcells.html

http://www.isolagen.rusmed.ru

Культивирование и трансплантация клеток и тканей фибробластов — область биомедицины, имеющая начало более века назад, но получившая свое настоящее развитие в последние 30-40 лет, когда появились методики, обусловившие возможность культивирования отдельных клеток. Сегодня значительное количество клеток, из 200 составляющих человеческий организм, успешно размножаются in vitro. В их число входят и фибробласты.

Следствием развития и совершенствования клеточной биологии явилось формирование нового направления клеточной и тканевой инженерии, относящегося к биомедицинской технологии, основанной на использовании культивированных клеток человека. Задача этого направления — обеспечение замещения, восстановления поврежденных тканей за счет имплантации или трансплантации выращенных in vitro клеток из здоровых тканей и органов. Возможность культивирования в достаточном объеме необходимых для практики фибробластов делает реальным их использование в клинике. В России это направление получило развитие в ряде научных и практических учреждений: Институт цитологии РАН, Военно-медицинская академия МО РФ, Институт хирургии им. А.В. Вишневского РАМН, Институт кардиологии МЗ РФ, НИИ трансплантологии и искусственных органов, Институт Клеточных Технологий и др.

Фибробласты - основные клетки соединительной ткани. Эти клетки имеют мезенхимальное происхождение и морфологически характеризуются как клетки круглой или удлиненной, веретенообразной плоской формы с отростками и плоским овальным ядром. Фибробласты синтезируют тропоколлаген, предшественник коллагена, межклеточный матрикс и основное вещество соединительной ткани, аморфное желе подобное вещество, заполняющее пространство между клетками и волокнами соединительной ткани. Участвуют в заживлении ран. В результате дифференцирования фибробласты превращаются в менее активные зрелые клетки - фиброциты.

 

См. на сайте: http://www.medlink.nm.ru/stemcells.html  

Рис. 1 Образование фибробластов

 

Около 100 лет тому назад в связи с развитием методов поддержания клеток in vitro со всей остротой встал вопрос о том, ограничен ли потенциал клеток многоклеточного организма. A.Каррель культивировал фибробласты сердца куриных эмбрионов в культуре в течение 34 лет, при этом клетки прошли тысячи делений без изменений их морфологического строения или скорости роста. Эти опыты встретили серьезные возражения. В частности, указывалось, что несовершенство методов культивирования приводило к внесению свежих клеток в культуры при каждом их пересеве. С другой стороны, онкологам хорошо известны многочисленные штаммы перевиваемых in vivo и in vitro опухолевых штаммов и линий, которые поддерживаются в течение многих лет, иногда десятков лет, клетки которых являются практически бессмертными (иммортализированными). Наряду с этими опытами, появились наблюдения о том, что в клеточных культурах все же не удается длительно поддерживать клетки, полученные из нормальных, не опухолевых тканей.

 

В 1961 г. L.Hayflick и P.S.Moorhead представили данные о том, что даже в идеальных условиях культивирования фибробласты эмбриона человека способны делиться только ограниченное число раз (50 +/-10). Было установлено, что при самом тщательном соблюдении всех мер предосторожности при пересевах клетки проходят in vitro ряд вполне морфологически различимых стадий (фаз), после чего их способность к пролиферации исчерпывается и в таком состоянии способны находиться довольно длительное время. В повторных опытах это наблюдение было многократно воспроизведено, последняя фаза жизни клеток в культуре была уподоблена клеточному старению, а сам феномен получил по имени автора название лимита Хейфлика. Более того, оказалось, что с увеличением возраста донора число делений, которые были способны совершить клетки организма, существенно уменьшалось, что привело к представлению о существовании гипотетического счетчика делений, ограничивающего общее их число.

После установления лимита Хейфлика и фактов, что нормальные фибробласты в культуре сохраняют диплоидный кариотип и имеют низкую экспрессию антигенов гистосовместимости и отсутствие онкогенных потенций, стало возможно использование культивируемых вне организма фибробластов человека для терапевтических целей. Научные исследования и клинические разработки в данном направлении протекают очень интенсивно, что связано с общим подъемом клеточных технологий на основе стволовых клеток.

Попытки использовать культивируемые вне организма фибробласты для терапевтических целей начали предприниматься вскоре после установления фактов, что нормальные фибробласты в культуре сохраняют диплоидный кариотип и имеют ограниченную продолжительность жизни, низкую экспрессию антигенов гистосовместимости, отсутствие онкогенных потенций. Было показано, что пересаженные аллогенные фибробласты оказывают непосредственное влияние на заживление ран (Ross, 1968) и на эпителизацию (Coulomb et el, 1989). Появились данные, что фибробласты могут продуцировать коллагены I и II типов (Varga et al., 1987) и компоненты внеклеточного матрикса: ламинин, нидоген, тинасцин, хондроитин-4-сульфат, протеогликан (Halfter et al., 1990), фибронектин (Matsura, Hakamori, 1985), некоторые факторы роста, а также другие вещества.

В настоящее время имеется значительное число работ, свидетельствующих о большой роли факторов роста в эпителизации кожи. Факторы роста — это регуляторные пептиды (тканевые гормоны), вырабатываемые клетками различных типов, которые в значительной степени ускоряют регенераторный процесс. Многие факторы роста продуцируются фибробластами:

      1. Основной фактор роста фибробластов (bFGF) положительно влияет на рост всех типов клеток кожи, стимулирует продукцию компонентов внеклеточного матрикса фибробластами (фибронектина и коллагена), стимулирует хемотаксис фибробластов и выработку ими новых волокон коллагена, эластина и фибронектина;

2. Трансформирующий ростовой фактор (TGF-бета) стимулирует хемотаксис фибробластов и продукцию ими коллагена и фибронектина (Капе С. et al., 1991).

3. Трансформирующий ростовой фактор (TGF-альфа) влияет на ангиогенез (Chen J., et al., 1993). Продуцируемые фибробластами факторы роста могут ускорять восстановление пораженной дермы, что во многом объясняет стимулирующее воздействие аллогенных клеток на заживление ран.

    4. Эпидермальный фактор роста (EGF)-усиливает пролиферацию и миграцию кератиноцитов;

    5. Фактор роста кератиноцитов (KGF)-усиливает заживление и эпителизацию ран;

    6. Трансформирующий фактор роста (a-NGF)   активно влияет на ангиогенез.

Кроме того, фибробласты продуцируют компоненты внеклеточного матрикса: нидоген, ламинин, тинасцин, хондроитин-4-сульфат, протеогликан.

 

В Институте хирургии им. А.В.Вишневского РАМН разработан и внедрен в клиническую практику новый метод лечения обширных ожоговых ран, принципиально отличающийся от ранее предложенных, основанный на использовании культуры аллогенных фибробластов (Д.С.Саркисов, В.П.Туманов с соавт., 1990; В.Д.Федоров, Д.С.Саркисов с соавт., 1993; Д.С.Саркисов, А.А.Алексеев с соавт., 1994). Предпосылкой к его разработке стали предшествовавшие фундаментальные исследования регенераторного процесса, показавшие ключевую роль в нем фибробластов (В.В.Серов, А.Б.Шехтер, 1982; Е.А.Ефимов 1984; Л.И.Бобро 1990; B.Coulomb, L.Dubertret et. al., 1984; B.Coulomb, P.Satag, et al. 1986), а также установившие факт частичной потери фибробластами поверхностных антигенов гистосовместимости в процессе культивирования (P.Хэй 1989; J.Nanchahal, et al. 1989).

 

Патогенетический механизм действия предложенного метода заключается в синтезе аллогенными фибробластами экстрацеллюлярного матрикса, факторов роста, стимуляции пролиферации собственного эпителия, направленных на восстановление как эпидермального, так и дермального компонента кожи. При ожогах 3А степени и длительно незаживающих ранах трансплантацию 3-х дневной культуры аллофибробластов осуществляют непосредственно на подготовленные в результате комплексного лечения раны. При глубоких ожогах 3B, 4 степени трансплантацию аллофибробластов сочетают с аутодермопластикой с коэффициентом расширения 1:6 и более. В последнем случае аллофибробласты стимулируют эпителизацию ячеек аутотрансплантата.

 

Накопленный клинический опыт в различных ожоговых центрах и отделениях (А.А.Алексеев, А.Ю.Яшин 1996; А.А.Алексеев, Д.А.Саркисов с соавт., 1997; С.И.Воздвиженский, Л.И.Будкевич с соавт., 1996; Матчин Е.Н., Потапов В.Л., Огольцова В.А. 1996; Д.Я.Алейник, В.А.Аминев с соавт. 1998; Н.М.Кузнецов, О.Н.Мазка с соавт. 1998), показал его высокую эффективность. Преимуществами метода являются - небольшие сроки культивирования аллофибробластами (3 суток), хорошее приживление трансплантатов (в среднем 97 %), возможность создания банка аллогенных клеток, относительно небольшая себестоимость.

В детском ожоговом центре при ДГКБ № 9(А.К.Штукатуров; А.А. Бахарев, Г.З. Сайдгалин Н.А. Шмелева)  ежегодно проходит лечение 370-420 детей, пострадавших от ожогов. Из них у 130-150 детей определяются глубокие и распространенные ожоги, у 35-40% которых для ускорения эпителизации возможно применение клеточных культур.  Общая площадь глубокого поражения, требующего оперативного лечения, у них составляет до 35-40 тысяч кв. см в год. При принятой методике предоперационной трансплантации аллофибробластов, в соотношении 30-60 тыс. клеток на см2 пораженной кожи, потребность в культуре фибробластов составит 1,2-2 млрд. клеток в год. При успешной разработке метода с использованием эпителиальных клеточных пластов их потребность может составить до 45-50 тыс. кв. см в год.

Аллофибробласты выращивались в лаборатории клеточных культур ЕНИИВИ. Пролечено 27 больных с термическими поражениями 3-4 степени общей площадью поражения от 4 до 56%. Применение культуры аллофибробластов для предоперационной трансплантации на рану с целью ускорения эпителизации раны у больных с глубокими ожогами оказалось оправданным. Культура аллофибробластов применялась либо в виде взвеси, либо на подложке на основе биосинтетического покрытия "Фолидерм".

Показаниями к использованию метода для лечения глубоких ожогов у детей является наличие ожогов ЗА, 3В, и 4 степени более 10% площади тела, дефицит донорских ресурсов, длительно незаживающие гранулирующие раны. Абсолютных противопоказаний к использованию метода нет. Относительными противопоказаниями являются: общее крайне тяжелое состояние больного, недостаточно подготовленная рана с обсемененностью раны более 100 000 микробных тел на 1 гр. ткани, наличие грибковой флоры.

 

См. на сайте: http://www.medlink.nm.ru/stemcells.html

Рис. 2. Фибробласт - основная секреторная клетка, участвующая в  формировании соединительной ткани. Иммунофлуоресцентная световая микроскопия показывает фибробласты кожи эмбриона человека: клеточные ядра (синие), цитоплазма (красная) - фибронектин, сеть коллагеновых волокон (зеленая)

 

Результаты внедрения метода в ДГКБ № 9 показали высокую эффективность и экономическую целесообразность внедрения данной технологии для лечения тяжелых больных с термическими травмами.

В последнее время стали накапливаться данные о применении культивируемых in vitro фибробластов в стоматологии. О положительном эффекте лечения пародонтита с использованием культуры аллофибробластов, полученной из дермы плодов человека, недавно заявили отечественные исследователи (В.П. Туманов с соавт., 1998 г.). Данными авторами был разработан новый способ лечения воспалительно-деструктивной формы пародонтита с использованием культуры аллофибробластов человека, заселенных на твердую мозговую оболочку.

В своей диссертационной работе "Использование культивированных аллофибробластов в комплексном лечении заболеваний пародонта" Г.С. Рунова на основании полученных экспериментальных данных убедительно показала эффективность разработанного оригинального метода лечения хронического пародонтита при использовании культивированных аллофибробластов и твердой мозговой оболочки.

Преимущество данного способа лечения пародонтита заключается в том, что в раневом ложе при имплантации ТМО и аллофибробластов не происходит так называемого процесса биодеградации плодного материала и культивированных аллофибробластов, а имплантант встраивается в костный дефект и трансформируется в дальнейшем в грубоволокнистую костную ткань альвеолярных отростков. Культивированные аллофибробласты постоянно выделяют основной фактор роста (FGF), формируют экстрацеллюлярный матрикс, фибронектин и другие вещества, которые способствуют активации процессов ангиогенеза и дальнейшего остеогенеза.

В последнее время появились сообщения о возможности применения фетальных фибробластов для восстановительной терапии в косметологии.

В эмбриогенезе человека и млекопитающих образование нескольких сотен вариантов специализированных клеток происходит из пула зародышевых листков (эктодермы, энтодерма и мезодермы), а также мезенхимы. Мезенхима - это клеточная сеть рыхлой соединительной ткани, выполняющая множественные метаболические, сигнальные, механические (опорные) и морфогенетические функции.    

Фибробласты являются основным клеточным элементом среднего слоя кожи, называемого дермой. Кроме фибробластов, дерма содержит некоторые другие типы клеток, а также коллаген, эластин и гликозаминогликаны (межклеточное вещество), кровеносные сосуды и железы (потовые и сальные) Основная функция фибробластов - синтезировать и ресоздавать межклеточное вещество. Фибробласты синтезируют и выделяют в окружающую среду большое количество биологически активных веществ, среди которых можно выделить различные факторы роста, компоненты внеклеточного матрикса и ферменты, с помощью которых они разрушают коллаген и гиалуроновую кислоту, а также синтезируют эти молекулы заново. Этот процесс происходит непрерывно, и благодаря ему межклеточное вещество постоянно обновляется. Особенно интенсивно протекает метаболизм гиалуроновой кислоты.

Как и во всех органах и тканях человеческого организма, в коже происходят возрастные изменения в течение жизни. Одной из основных причин старения кожи является снижение пролиферативной и синтетической активности фибробластов. Особенно быстро утрачивается способность к синтезу межклеточного вещества. В то же время катаболические функции долгое время остаются на прежнем уровне. Поэтому в стареющей коже уменьшается толщина дермы, содержание влаги в ней падает, в результате кожа теряет  упругость и эластичность. Следствием этого является растяжение кожи и  образование морщин.

Продолжение  См. на сайте: http://www.medlink.nm.ru/stemcells.html

Рис. 3  Образование морщин

 

---

Источник материалов: www.medlink.nm.ru

Получить консультацию, пройти диагностическое обследование, а также лечение Вы можете у любого прошедшего у нас подготовку и аттестацию врача:  medlink@nm.ru

Описание сайтов о стволовых клетках и клеточных технологиях

http://www.isolagen.rusmed.ru   омоложение, омолодить, молодость, омоложениями, омолаживание, омолодиться, омоложение организма, омоложение лица, центр омоложения, технологии омоложения, элос омоложение, лечение стволовыми клетками, стволовые клетки, пуповинная кровь, гомеопат, гомеопатические препараты, гомеопатия, умственная отсталость, голодание, лечебное голодание, мезотерапия, фотоомоложение, фотоэпиляция, депиляция, электроэпиляция, эпиляция, пилинг, пиллинг, лечение акне, лечение угревой сыпи, лечение угрей, угри, инсульт, лечение инсульта, аденома, лечение аденомы, биологически активные добавки, бад, бады, биодобавки, диспорт, контурная пластика, рестилайн, ювидерм, как похудеть, похудение, похудеть

http://www.isolagen.rusmed.ru   мезотерапия, мезотерапией, мезотерапиями, мезотерапевтический, мезотерапию, мезотерапийный, препараты мезотерапии, мезотерапия волос, обучение мезотерапия, мезотерапия петербург, мезотерапия лица, отзывы мезотерапия, мезотерапия цена, фотоомоложение, фотоэпиляция, лазерная эпиляция, биоэпиляция, электроэпиляция, эпиляция, пилинг, пиллинг, косметолог, косметология, диспорт, контурная пластика, рестилайн, ювидерм, аппаратная косметология, клиника эстетической медицины, лифтинг, лишний вес, коррекция фигуры, парикмахерские услуги, липосакция, увеличение груди, пластика груди, миостимулятор, миостимуляция, клиника пластической хирургии, маммопластика, увеличение губ, удаление бородавок, удаление папилом, удаление папиллом, удаление родинок, омоложение, пластические операции, пластическая хирургия, татуаж бровей, татуаж губ, татуаж, ринопластика, сосудистые звездочки, гиалуроновая кислота

http://www.isolagen.rusmed.ru комплексное восстанавление волос, волосы, волосам, волосу, волосами, волосом, волосяные, алопеция, лечение волос, облысение и волосы,  выпадение волос, , лечение волосяных фаликул, клеточная технология в лечении волос,  наращивание волос, краска волос, маска волосы, стрижка волос, длинные волосы, рост волос, цвета волос, прически волосы, народные волос, уход волосы, профессиональная волосы, рецепт волосы, удаление волос, длинные волосы стрижки, выпрямление волос, укладка волос, фото волос, косметика волосы, укрепление волос, прически волосы длинные, народные средства волосы, волосы выпадают, волосы витамины, короткие волосы, против волос, окраска волос, окрашивание волос, средства выпадения волос, выпадение волос народные, против выпадения волос, волосы шампунь, натуральные волосы, купим волосы, выпрямитель волос, выпадение волос лечение, волосы утюг, профессиональная косметика волосы, модные волосы, восстановление волос, фен волосы, пересадка волос, щипцы волос, маски для лица, маски для ногтей, уход за ногтями, уход за кожей лица, уход за кожей, уход за лицом, маникюр, ногти, педикюр, уход за ногами, уход за телом, лечение облысения, облысение, londa, wella, красота, что такое красота, купероз, литокомплекс, аромамасла, ароматерапия, эфирные масла, витамины для кожи

Стволовые клетки -  сайт Изолаген  http://www.isolagen.rusmed.ru   - лечение новыми медицинскими технологиями, омоложение  - в г. Астана. тел. 8-926-1657796, применение стволовых клеток, стволовыми клетками, о стволовой клетке, омоложение стволовыми клетками , лечение стволовыми клетками, клеточные технологии, клеточная терапия, банк стволовых клеток, стволовые клетки стоимость, омоложение стволовыми клетками,

Ключевые слова сайта:  http://www.beauty.rusmed.ru Применение стволовых клеток, стоимость лечения стволовыми клетками, волосы, трихолог, трихология, алопеция, уход за волосами, депиляция, себорея, алопеция, выпадают волосы, лечение стволовыми клетками облысения, лечение выпадения волос, лечение себореи, лысина, трихология, средства от выпадения волос, причины выпадения волос, средства по уходу за волосами, средство облысение, средство от облысения, против облысения, перхоть, консультация трихолога, причины облысения, усиление роста волос, мезотерапия волос, фибробласта

Ключевые слова сайта http://www.isolagen.rusmed.ru : стволовые клетки, стволовая клетка, о стволовых клетках, про стволовые клетка, стволовыми клетками, клеточными технологиями, лечение стволовыми клетками, банк стволовых клеток, институт стволовой клетки, омоложение стволовыми клетками, пересадка стволовых клеток, применение стволовых клеток, хранение стволовых клеток, трансплантация стволовых клеток,

Лучшие сайты на тему: новейшие методики лечения патологий и заболеваний стволовыми клетками

Ключевые слова сайта http://www.stemcell.rusmed.ru:   лечение, лечить, излечение, лечиться, вылечить, вылечивание, излечивание, лечим, лечению, гайморита, лечат, народное лечение, методы лечения, средства лечения, народные средства лечения, лечение зубов, алкоголизм лечение, лечение детей, лечение волос, лечение рака, лечение препараты, лечение молочницы, способы лечения, лечение заболеваний, простатит лечение, лечение травами, лечение консультация врача, консультации, медицинская консультация, травник, курорты, курорты россии, клиники швейцарии, методы диагностики, удаление растяжек, санатории россии, санатории, восстановление, востановление, биорезонансная диагностика, биорезонансная терапия, плоскостопие, справочник болезней, болезни, как лечить герпес,  народные методы лечения, лечение геморроя, лечения хронических, лечение цистита, лечение грыжи, лечение железы, лечение псориаза, лечение герпеса, клиника лечение, лечение бронхита, матка лечение, лечение бесплодия, лечение позвоночника, лечение гепатита, лечение суставов, лечение насморк, лечение ангины, беременность лечение, лечение киста, санаторий лечение, лечение остеохондроза, лечение воспаления, симптомы лечение, язва лечение, лечение печени, лечение лишая, лечение хламидиоза, лечение диабета, рецепты лечения, лечение ногтей, лечение простуды, медицина лечение, диагностика, заболевания, симптомы, синдром, компьютерная диагностика, clinic, клиника, диагностический центр, народные средства, лечениям, лечениями,

http://www.info.rusmed.ru - все о стволовых клетках

http://www.cells.rusmed.ru - применение стволовых клеток

http://www.stemcell.rusmed.ru   - стволовые клетки в медицине

http://www.medlink.nm.ru   - стволовые клетки, медицина и стволовые клетки